蛋白是所有生物体的重要组成部分，执行着多种生物功能，包括复制和解码遗传信息、催化代谢反应、运输分子等^[1]。它们也是用于疾病诊断的重要生物标志物，许多难治疾病对应的蛋白生物标志物在生物体内表达水平极低，因此，具备高灵敏度和特异性的蛋白分析技术至关重要^[2]。目前，用于特异性生物标志物检测或蛋白浓度定量的生物分析方法主要包括酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度检测、Bradford蛋白检测和Lowry蛋白检测，这些是诊断炎症性疾病和病原性感染的可靠且直接的途径。ELISA被认为是免疫测定的金标准，在疾病评估和癌症检测等方面被广泛应用，例如监测心血管疾病^[3-5]、阿尔茨海默病^[6]和类风湿性关节炎^[7]。BCA、Bradford、Lowry 3种蛋白浓度检测方法主要在蛋白质组学研究中的样品定量和重组蛋白表达纯化过程的监测中应用。这些传统的蛋白检测通常在商业检测试剂盒中进行，提供了包括二抗、底物、酶标记物所需试剂，并在包被有抗原或抗体的96孔板中进行检测，以捕获靶蛋白或其他分子。尽管这些传统蛋白分析方法得到良好应用并展现出巨大潜力，但仍存在着检测操作流程复杂繁琐，灵敏度仍有待提升的问题。

近年来，光流控技术的出现为生物检测领域带来了巨大的改变。该技术将光学传感与微流控检测相结合，为蛋白分析提供了新的可能。本文基于有无标记物检测方式对光流控技术蛋白分析进行分类，详细介绍了各种蛋白分析技术的原理，探究了各类技术的优势和局限性。

1 基于光流控技术的有标记蛋白分析 1.1 基于光电二极管的蛋白分析

化学发光免疫检测是蛋白分析领域最常用的检测方法之一。该方法将目标分子与酶标记抗体结合，形成免疫复合物，并加入化学发光底物，产生化学发光信号。这种有标记物的蛋白分析同样适用于集成了各种光学探测器的光流控平台。光流控技术平台可集成硅光电二极管和有机光电二极管，用于检测反应产生的信号。

硅光电二极管因其响应时间短、噪声低等特点，在检测化学发光信号时表现出高灵敏度，特别适合检测微弱光信号，适用于低浓度分析物的灵敏检测。此外，硅光电二极管价格低廉、制造方便，能够满足一次性光流控芯片的大规模生产需求。Pimentel等^[8]利用氢化非晶硅光电二极管（a-Si:H）对溶液中的化学发光反应实时检测。由辣根过氧化物酶催化的鲁米诺氧化产生波长为425 nm的光，氢化非晶硅光电二极管在零偏压工作下检测到最低的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1 μg/mL。

相比之下，有机光电二极管在化学发光免疫检测中具有独特的优势。它们可以通过低成本制造方法在玻璃、塑料等多种材料上集成，适合应用到柔性或透明的光流控芯片中。有机光电二极管适用于浓度范围为nmol/L至μmol/L的异硫代氰酸荧光素或辣根过氧化物酶标记抗体的化学发光免疫检测和比色检测。通过抑制片上集成光电探测器的暗电流，可进一步提高检测限。Miyake等^[9]利用传统的光刻制作有机薄膜光电二极管（organic photodiode，OPD）基板并粘合到玻璃基板上密封。整个检测系统由两个注射泵、两个注射器、PDMS芯片、带通滤光片和LED、OPD和一个皮安计构成。实验结果表明，OPD对化学发光反应的检测表现出良好的灵敏度，并且能够测量大约0.1 nA水平的光电流。

基于光电二极管的化学发光免疫分析原理如图1所示。目标分子与抗体形成的免疫复合物和发光底物在检测腔室内反应，由光电二极管检测反应信号。

1.2 基于光流控激光器的蛋白分析

光流控激光器为蛋白检测提供了一个超高灵敏度的卓越平台。这种检测通常在微流体通道中进行，通道的顶部和底部涂有反射层，在微通道内形成法布里−珀罗（FP）谐振腔，其工作原理如图2所示。FP谐振腔增强了光与流体的相互作用，并且激光在某一时间突然发射，信号强度急剧上升。

在ELISA检测中，目标分子与酶标抗体结合，在酶催化反应生成的产物浓度达到一定的阈值后，激光器发射激光。由于目标分子浓度越低，酶与底物的反应时间越长，反应产物达到阈值浓度的时间越长。因此，可以推算出激光的起始时间（反应开始到激光发射的时间）与目标分子浓度成反比，通过监测激光起始时间间接推算目标分子的浓度，从而实现蛋白分析。图3展示了光流控激光器在ELISA检测中的原理。

这种方法对低浓度目标分子具有极高的灵敏度和宽动态范围检测。例如，Tan等^[10]开发了一种基于ELISA检测的光流控激光平台，该平台通过两面反射镜有距离的夹在一起，形成FP谐振腔，从而完成小样品、大动态范围的检测。该平台应用在IL-6检测时，每孔15 μL样品/试剂，可在1.5 h内达到约0.1 pg/mL的检测限。与传统的ELISA实验中的检测时长长达4～6 h相比，基于光流控激光器的蛋白分析检测时长远远小于传统ELISA检测，这种技术展示了光流控激光器在蛋白检测中的应用潜力。

2 基于光流控技术的无标记蛋白分析 2.1 基于表面等离子体共振（SPR）技术的蛋白分析

除了在光流控芯片中集成光学元件检测有标记的蛋白分析外，基于表面等离子体共振（SPR）的无标记蛋白分析具有广阔的应用前景。SPR技术的核心原理如图4所示，金膜表面固定抗体，当入射光以特定的角度（共振角）发射到金膜表面时，光波激发金膜表面的自由电子振荡，形成表面等离子体波。将含有目标蛋白的溶液加入微通道，这时目标蛋白与固定抗体结合导致表面折射率发射变化，从而共振角发生偏移。实时记录共振角偏移量，以达到监测生物分子相互作用的目的。

Tokel等^[11]利用SPR技术提出了一种便携式、低成本的表面等离子体共振平台，能够对大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）进行快速检测。将抗体固定在金膜上，细菌被微通道内的抗体捕获，从而引起了折射率的变化。利用传感器捕获图像，实时计算共振角，展示共振角随时间变化的曲线。这种无标记SPR平台，解决了当前POC生物传感工具的一些主要问题，还能适用于其他病原体的免疫诊断方面。此外，Xiao等^[12]研发了一种小型且经济实惠的3D打印一体式微流体耦合SPR芯片，用智能手机摄像头记录相应的传感图。该系统可实现β2-微球蛋白的检测，得到基于SPR技术的系统响应在10～200 nmol/L范围内与β2-微球蛋白浓度呈线性（R²= 0.986），且最低检测限（limit of detection，LOD）达到1.5 nmol/L。

2.2 基于表面增强拉曼散射（SERS）技术的蛋白分析

除了监测共振角的偏移之外，还能通过光谱分析对蛋白进行无标记监测。基于表面增强拉曼散射（SERS）技术的无标记蛋白分析通过检测蛋白自身的拉曼信号实现。SERS技术的基本原理如图5所示，利用分子吸附或特异性捕获将蛋白固定在金属纳米结构表面（如金/银纳米颗粒阵列、纳米棒等SERS基底），用激光照射样本区域，基底表面的蛋白分子会产生增强的拉曼信号，从而实现无标记蛋白的高灵敏度分析。

Yesilkoy等^[13]开发了一种纳米结构的金纳米孔阵列，可在大面积上增强来自表面附近极小体积（小于100 nm）的相位信号，可同时监测数千个微阵列元素的生物传感器，检测质量浓度低至500 ng/mL。Sun等^[14]利用SERS技术在血清检测中具有快速、简单、灵敏度高的独特优势，对肝癌患者进行筛查。通过采集60名肝癌患者（27名T1和T2期肝癌患者，33名T3和T4期肝癌患者）和40名健康志愿者的血清，进行低丰度蛋白（LAP）检测并获得高质量的SERS光谱信号。通过对这些光谱信号一系列分析，能够有效区分肝癌患者和健康志愿者，甚至实现了早期肝癌（T1~T2期）的筛查，准确率高。此外，Rickard等^[15]开发了一种光流控设备，SERS活性衬底通过利用电流体动力学制造的亚微米柱组成，这些微柱覆盖着等离子体活性纳米金层，集成在光流控芯片中，用来检测脑外伤的生物标记物。结果显示，在1fmol/L到100 nmol/L的范围内，拉曼强度与脑外伤生物标记物浓度呈现出良好的线性关系，有助于创伤性脑损伤的即时诊断。

2.3 基于导模共振光栅（GMR）的蛋白分析

导模共振（GMR）是一种基于光栅耦合和波导模式共振的传感技术，在无标记的蛋白分析中广泛应用。其主要原理如图6所示，入射光以特定的角度照射到光栅上，光被耦合到波导层，形成驻波。在满足相位条件时，特定波长的光发生共振，在光谱中出现尖锐的峰。波导层表面固定抗体以捕获目标蛋白，当结合反应发生时，局部折射率升高，导致共振波长发生位移，从而计算目标蛋白的浓度。

Li等^[16]开发了一种集成了GMR传感器的光流控芯片，可同时实现血浆分离和无标记蛋白检测。光流控芯片在0～500 μg/mL的质量浓度范围内成功检测到检测限为0.158 μg/mL的白蛋白，从而证实了直接从血液样本中定量检测生物标志物的可行性。Tsai等^[17]设计了用于过滤血细胞的微柱阵列，仅允许血浆流过并到达GMR生物传感器，以进行实时监控。观察使用不同浓度的C反应蛋白（CRP）获得的原始反射光谱，随着CRP浓度的增加，峰值（谐振）波长向更长的波长偏移。他们并总结了3次平行实验下不同浓度下峰值波长相对于基线信号的变化，得到了可靠的结论。此外，Kenaan等^[18]采用先进的微纳加工技术，将多个GMR传感器制作在一个光流控芯片上，实现多个样本的平行检测，如肌钙蛋白、降钙素原和C反应蛋白的同时检测，检测限达到10 pg/mL。上述研究表明，在GMR生物传感器中进行无标记蛋白检测时，共振波长随纳米结构上附着的蛋白浓度而变化。

3 光流控技术的有无标记蛋白分析对比

为系统梳理光流控蛋白分析中各类检测方法的特性差异，本章围绕检测原理、优点与缺点，对光电二极管、光流控激光器、SPR、SERS和GMR蛋白分析技术展开总结，结果见表1。

4 结　论

从传统的蛋白分析到基于光流控技术的蛋白分析是生物诊断过程中的一次重大的飞跃。有标记的蛋白分析有着高灵敏度，但仍存在标记复杂性的问题；而无标记蛋白能够实时的监测分子之间的相互作用，但在便携性和抗干扰能力上仍有待突破。因此，进一步关注和研究光流控在生物诊断上的改进至关重要。目前所述的这几种检测技术存在以下问题并提出可能的解决方法：（1）复杂样本中标记物或自发荧光可能会存在干扰，因此需要开发出更稳定的标记物或利用新技术降低背景噪声。（2）光流控检测激光器阈值受到多因素影响，开发一个智能化控制系统实时控制反应条件有利于激光起始时间的准确性。（3）SPR技术需要精密的光学系统导致增加成本以及样本中非特异性吸附影响检测精度，需要对表面修饰物质进行优化并降低成本。（4）SERS技术现有的拉曼基底多以贵金属纳米基底为主，制备步骤繁琐，材料昂贵，研制出高活性的非贵金属拉曼基底非常关键^[19]。（5）GMR技术需要与波导匹配的入射光，以及昂贵的光谱分析仪器来确定峰值波长。因此制造出便携式、低成本的仪器以满足光流控技术下的蛋白分析是一项巨大的挑战。未来，将创新与实际临床需求结合，光流控技术在蛋白分析上的应用会越来越广泛。