在现代生物技术中，荧光微阵列检测技术具有重大意义，该技术在生命科学与医学研究领域均得到了广泛的应用^[1]。微阵列技术作为一种高通量生物检测技术，其优势在于单个微阵列芯片可以同时靶向数千个分子，加快实验进程，同时结合数据分析可提高检测准确性^[2-3]。大多数微阵列检测系统在使用特定波长的光源激发荧光染料标记的DNA探针时，会发射相应波长的荧光。这些被激发的荧光可通过特定的光学系统高效捕获^[4-9]，结合图像处理算法可以有效抑制背景噪声，以提高检出灵敏度与准确率^[10]。

Hamilton等^[11]构建了一种用于微阵列定量成像的大视场电荷耦合器件（charge-coupled device，CCD）。该器件对Cy3和Cy5的检测灵敏度可达到1 分子·mm⁻²，适用于核酸微阵列研究。Hedde等^[12]设计了一种用于 COVID–19 抗体检测的低成本、便携式、模块化微阵列成像系统，其检测结果与昂贵的商业微阵列阅读器相当，且两种仪器检测结果的相关性大于0.85。Kozma等^[13]设计的新型手持式荧光微阵列检测仪（portMD–113）为床旁诊断应用提供了新的解决方案。该设备没有复杂的机械结构，采用电池供电，具有成本低、重量轻、操作简便、检测时间短的优势，在个性化医疗的多参数分析方面具有潜在应用前景。Khalilabad等^[14]将图像处理技术引入微阵列图像检测中，使疾病检测准确率达到94.11%以上。

现有的商业扫描仪包括 SpinScan、GenePix、Affymetrix、Genomic Solutions、Tecan PowerScanner和北京博奥生物芯片扫描仪等。它们均可对微阵列芯片实现高灵敏检测^[15-17]。其中大部分扫描仪是基于共聚焦扫描成像光路设计的，但由于成像过程依赖复杂的光学组件和精密的机械扫描装置，设备通常体积庞大、操作繁琐，且扫描速度缓慢，难以满足现场快速检测的需求。传统 CCD 宽场成像受限于较低的灵敏度，在检测微量生物标志物时往往难以准确识别，无法实现高灵敏度检测^[18-20]。

本文讨论的生物标志物微阵列芯片成像检测系统基于共聚焦型光路成像原理，结合维纳滤波反卷积算法与阈值背景矫正算法，减少了点扩散函数在成像过程中引起的模糊及噪声干扰，以提高系统信噪比，提升检测灵敏度。针对多种阿尔茨海默病标志物，系统测得β淀粉样蛋白42（Aβ42）的检出限为8.60 pg/mL，磷酸化tau 181蛋白（P-tau181）的检出限为20.60 pg/mL，总tau蛋白（T-tau）的检出限为13.12 pg/mL，相较于博奥微阵列芯片扫描仪，缩短了成像时间，提高了检测效率与准确率。

1 方法与材料 1.1 生物标志物微阵列成像检测光路

实验中，采用荧光染料Cy3标记生物蛋白，其荧光激发波长峰值为550 nm，荧光发射波长峰值为570 nm。生物标志物成像检测系统中的光路采用共聚焦光路成像原理，在激发光路中绿光LED（大恒光电，3 W，波段（528±10） nm ） 发出的激发光通过激发滤光片（Thorlabs 540 nm，半峰全宽为10 nm）、二向色镜（Thorlabs 550 nm长通）、平场消色差物镜（Olympus 10×，数值孔径为 0.25）后照射到样品上。样品放置在微米级别的xy高速电动扫描位移台（Thorlabs）上。在荧光发射光路中，荧光经过上述物镜、二向色镜、发射滤光片（Edmund 592 nm，半峰全宽为 46 nm）、消色差双胶合透镜（Thorlabs，焦距为100 mm）后到达光电探测器（SCMOS）。整体成像光路与实际光路图如图1（a）和（b）所示。

1.2 生物标志物微阵列芯片制备

生物标志物微阵列芯片制备的具体步骤为：用含1% BSA的PBS将Aβ42、P - tau181和T - tau捕获抗体分别稀释至1 mg/mL。将稀释后的样本置于384孔板，以4 000 r/m离心1 min后，通过生物芯片点样仪将蛋白点样到高分子材料修饰的载玻片上。载玻片在4 ℃环境中放置8 h后转至−80 ℃条件下储存。将检测抗体按不同浓度溶于1倍体积的PBS后，加入10倍体积缓冲液，再加入Cy3荧光染料，反复移液或振荡使其充分混合，室温避光静置60 min。加入淬灭剂，室温孵育10 min中止偶联反应。生物标志物完全结合产生有效荧光信号后，用含0.05% Tween的PBS洗涤微阵列芯片3次，每次5 min，1 000 r/m离心干燥2 min后进行检测实验。

1.3 生物标志物微阵列芯片成像检测系统算法去噪

本研究联合使用了维纳滤波反卷积与基于阈值分割的背景矫正算法来对图像进行去噪声处理。反卷积是一种针对成像系统中，由于光学系统点扩散函数（point spread function，PSF）造成图像模糊而进行的去卷积操作，其目的是复原出更接近原始图像的清晰图像^[21-23]。根据瑞利判据来计算本系统的分辨率

$ R=\frac{0.61*\lambda }{{A}_{{\mathrm{n}}}} $

(1)

式中：$ R $为分辨率；$ \lambda $为光波长；A_n为数值孔径。

由式（1）算得本系统的分辨率为1.39 µm。利用远小于系统分辨率极限的、100 nm的荧光微球模拟理想状态下的点光源来标定PSF，如图2（a） ~ （c）所示。在图像退化模型中，理想的图像 $ f\left(x,y\right) $经过退化函数（点扩散函数）$ h\left(x,y\right) $的卷积以及噪声$ \eta \left(x,y\right) $的干扰后，得到退化图像在空间域的表现形式$ g\left(x,y\right) $，即

$ g\left(x,y\right)=h\left(x,y\right)*f\left(x,y\right)+\eta \left(x,y\right) $

(2)

维纳滤波的目标就是在频域中找到一个合适的滤波器$ \widehat{F}\left(u,v\right) $，使得退化图像在频域表示形式$ G\left(u,v\right) $经滤波后得到的估计图像$ \widehat{f}\left(x,y\right) $尽可能地接近原始图像$ f\left(x,y\right) $，也就是使估计图像与原始图像之间的均方差$ E\left[{\left(f\left(x,y\right)-\widehat{f}\left(x,y\right)\right)}^{2}\right] $最小。

基于阈值分割的背景矫正算法原理是：设定一个阈值，然后通过比较每个像素的灰度值与该阈值的大小关系，将图像划分为前景和背景两个部分，后续再用原始图像中的每个像素值减去对应的背景估计值，以此来去除背景对图像的影响，突出图像中的有用信息，达到背景矫正去噪声的效果。

1.4 误差分析与测量统计

使用ImageJ分析目标区域荧光信号强度。平均荧光信号强度定义为总荧光信号强度除以图像区域面积。每个实验重复3次，计算平均值并在图中标注标准差。利用 MATLAB 对图像峰值信噪比进行定量分析；针对不同模型间的差异构建线性回归模型，并基于 MATLAB 计算决定系数（R²），以此评价该回归模型的拟合优度。

2 实验结果与分析 2.1 生物标志物微阵列芯片成像检测系统算法处理结果

微阵列芯片固定在xy高速电动扫描位移台上。控制位移台，使样品移动至物镜的出瞳处，调节z轴位移台，将SCMOS中的图像调整至最清晰。SCMOS曝光时间设置为5 s，得到的原始图像见图2（d）。

由图2（d）可知，SCMOS采集的原始图像存在大量噪声。经维纳滤波反卷积算法处理后，PSF相关的图像噪声得到抑制，结果如图2（e）所示，但图像中仍存在非PSF引起的背景噪声。这部分噪声经后续的背景矫正后，结果如图2（f）所示：噪声被完全抑制，为后续的定量检测与检出限计算提供了有利条件。

利用MATLAB分别计算经反卷积和背景矫正后所有微阵列图像的峰值信噪比（peak signal-to-noise ratio，PSNR）。反卷积图像与原始图像相比，PSNR最高为29.04 dB；背景校正图像与反卷积图像相比，PSNR 最高为 27.78 dB。PSNR越高，表明处理后图像与原始图像越接近，失真程度越低。综合评价结果显示，原始图像经反卷积与背景校正处理后，质量得到明显优化。

分别截取各浓度梯度下的微阵列样品点，再按照浓度梯度由高到低的顺序拼接，得到一张完整的微阵列芯片图像，结果如图2（g）所示。将此图像与博奥芯片扫描仪所获取的微阵列成像图 （图2（h） ）进行对比分析。结果表明，本系统采集的图像经反卷积与背景校正处理后，其清晰度显著优于博奥芯片扫描仪的成像结果，且图像的浓度梯度区分度良好。

2.2 生物标志物微阵列芯片成像检测系统的灵敏度

为定量研究本成像系统的检测灵敏度与准确性，分别使用本系统与博奥公司的芯片扫描仪测量不同阿尔茨海默病生物标志物微阵列芯片的荧光信号强度，剔除异常值后进行Logistic参数拟合，以获取各生物标志物的标准曲线，结果如图3所示。所制备生物芯片阵列中单个样本点的直径为200 µm；每个相同浓度区域内阵列共有2排，每排5个样点；同一浓度阵列样点间点行间距为50 µm，点列间距为100 µm；相邻浓度梯度阵列间行间距为8.5 mm。在0 ~ 100 µg/mL 范围内，按照10倍稀释来确定标准品检测浓度，即分别配置Aβ42、P-tau181和T-tau质量浓度为 100 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 µg/mL、10 µg/mL、100 µg/mL的标准品溶液，一式三份进行实验。

根据图3（a） ~ （f）所示的标准曲线对检出限进行计算分析，计算式为

$ {D_{\mathrm{lim}}}=A2+\frac{(A1-A2)}{1+{\left(\dfrac{Y+X}{{X}_{0}}\right)}^{P}} $

(3)

式中：D_lim为最低检出限；$ A1 $、$ A2 $、$ {X}_{0} $和$ P $为逻辑回归拟合方程中的参数；$ X $为空白样品的荧光强度值；$ Y $为空白样品的荧光强度的标准差。

由式（3）计算出的结果详见表1。由表1可知，本系统对微阵列芯片中目标生物标志物Aβ42、P-tau181、T-tau的检出限分别为8.60、20.60 和13.12 pg/mL；相同条件下，博奥生物芯片扫描仪对Aβ42、P-tau181、T-tau的检出限分别为9.7 pg/mL、130.0 pg/mL和4.6 ng/mL。同时，利用式（3）计算处理前后各生物标志物的检出限，结果如表2所示。

系统加入的去卷积与背景矫正算法抑制了大部分背景噪声，极大地提高了系统检出限^[24-25]。上述结果表明，本系统可准确检测出 pg/mL 量级的阿尔茨海默病目标生物标志物，在相同条件下，其检出限优于博奥生物公司的芯片扫描仪；并且各项生物标志物逻辑回归拟合曲线的决定系数（R²）均大于 0.99，所测标准曲线能够精准反映检测荧光信号与生物标志物浓度之间的对应关系，具备良好的有效性与可靠性，可为实际检测应用提供准确的定量依据。

2.3 生物标志物微阵列芯片成像检测系统稳定性与重复性

图4（a）所示为相同条件下，利用本系统对同一阿尔茨海默病生物标志物微阵列芯片上 3 种不同浓度梯度样品进行 10 次重复性检测的结果，SCMOS 曝光时间设置为 5 s。根据图4（a）所示结果，利用变异系数（coefficient of variation）C_v检测结果重复性，其计算式为

$ {C}_{\mathrm{v}}=\frac{D_{\mathrm{s}}}{\overline{X}}\times 100\text{%} $

(4)

式中，$ D_{\mathrm{s}} $为标准差。计算结果显示，生物标志物微阵列芯片成像检测系统的重复性指标C_v≤3.8%。

为评估系统检测信号的稳定性，对同一阿尔茨海默病生物标志物微阵列芯片上3种不同浓度梯度样品进行连续性检测。每30 s记录一次检测芯片的荧光强度变化情况，并用C_v进行结果分析。如图4（b）所示，3种浓度样品的荧光强度值在300 s内保持相对稳定，强度波动范围不超过3.9%，表明生物成像检测系统在一定时间内具有良好的稳定性。

为检测本系统与商业芯片扫描仪检测结果的一致性，对同一生物标志物微阵列芯片分别使用本系统与博奥芯片扫描仪进行成像实验，提取荧光信号，并对两组数据进行归一化拟合处理，结果如图4（c）和（d）所示。由图4（d）可知，本系统与博奥芯片扫描仪的相关性为0.96，两者具有良好的相关性。由此表明，本系统的检测结果与商业芯片扫描仪结果的一致性良好。

3 结　论

本文提出了一种面向具有特定荧光信号的生物标志物微阵列芯片的快速、高灵敏度成像检测系统。该系统结构简单、易于操作，且克服了传统激光共聚焦扫描成像技术原理复杂，传统 CCD 宽场成像灵敏度偏低的问题。通过对多种阿尔茨海默病生物标志物进行检测，所得结果显示：本系统对 Aβ42的检出限为 8.60 pg/mL，P-tau181为 20.60 pg/mL，T-tau为 13.12 pg/mL；标准曲线的决定系数 R² 均大于 0.99，测量重复性指标 C_v≤3.8%。与博奥生物芯片扫描仪相比，本系统显著提升了检测灵敏度与准确率。该系统在疾病诊断、早期筛查及医疗保健领域具有广阔的应用前景，对优化医疗资源配置、提升医疗保障水平具有重要价值。