飞秒激光技术因其超快的脉冲宽度和超高的峰值功率，在材料加工领域展现出了独特的优势^[1-2]。与传统的激光技术相比，飞秒激光能够在极短的时间与材料发生非线性效应，从而实现亚微米级别的高分辨率加工。此外，飞秒激光还具有极低的热影响区，可在不损伤材料基质的情况下实现高精度加工^[3-6]。因此，飞秒激光技术被广泛用于微纳光学器件、生物微驱动、细胞培养和组织工程等领域^[7-8]。

近年来，水凝胶因其具有良好的生物相容性、可调控的机械性能和高含水量等独特的物理化学性质，被广泛应用于组织工程、药物递送、细胞体外培养等多种领域，受到了广泛关注^[9-11]。重组Ⅲ型人源化胶原蛋白（rhCol Ⅲ）是一种具有优异生物相容性和组织修复特性的水凝胶材料。其独特的164.88°柔性弯曲结构使它具有较高的细胞黏附性能，细胞黏附率可达天然胶原蛋白的190%。它拥有与人体自身胶原蛋白相似的功能，并且能够与人体细胞迅速结合^[12]。此外，其丰富的带电基团可结合大量水分子，使其拥有较强的亲水性及高水溶性，这为各类细胞的生长、分化与增殖营造了优良的微环境^[13-14]。目前使用rhCol Ⅲ制成水凝胶培养细胞的工作已取得显著进展。2021年，Hu等^[15]将rhCol Ⅲ和多功能抗菌纳米颗粒混合制备成一种多功能微环境响应性水凝胶。该研究采用水凝胶提取液的形式进行细胞培养。这种水凝胶可以在慢性糖尿病创面迅速降解，并程序化释放不同治疗物质。首先释放具有抗氧化和抗炎作用的多功能抗菌纳米颗粒，后续释放的rhCol Ⅲ可以刺激细胞增殖、迁移和血管生成，两个过程相互配合使慢性糖尿病创面实现更快、更好的愈合。2022年，Xu等^[16]以蒙巴拉链霉菌转谷氨酰胺酶为交联剂，混合外泌体，制成了孔径均匀、生物相容性好的rhCol Ⅲ水凝胶。通过细胞实验检测，结果表明rhCol Ⅲ-EVs水凝胶有效地促进了巨噬细胞由M1型向M2型转化，促进了小鼠纤维细胞的迁移和人脐静脉内皮细胞的血管生成。体外修复治疗表明，该rhCol Ⅲ−外泌体复合水凝胶能够促进糖尿病创面的组织再生和胶原沉积。2024年，Wu等^[17]采用循环冷冻干燥与解冻方法制备了以rhCol III和聚乙烯醇组成的水凝胶网络，该网络形成了一层均匀连续的凝胶涂层，赋予了材料卓越的抗钙化特性。此种新型复合水凝胶材料不仅提高了心瓣膜的抗凝血、抗炎和抗钙化性能，还促进了内皮细胞的快速内皮化，延长了心瓣膜的使用寿命。然而，目前关于重组rhCol Ⅲ水凝胶的制备方法主要依赖于自组装或化学交联，这些方法在精度和自由度方面存在局限性，而且可能引入毒性物质损害胶原蛋白的生物活性^[18-19]。尤其在当前细胞培养领域，对高分辨率、复杂性结构水凝胶支架的需求与日俱增，亟需开发更高精度和自由度的制备方法。飞秒激光具有超短脉冲和高峰值功率的特性，可对生物蛋白质材料实现亚微米乃至纳米尺度的加工精度。2013年，Gebinoga等^[20]使用近红外飞秒激光成功将未经修饰的天然I型胶原蛋白聚合成3D微结构，用于黏附和粘合细胞，这为使用天然聚合物3D培养细胞开辟了新途径。2015年，Bell等^[21]提出一种将I型胶原蛋白与黄素单核苷酸光敏剂混合进行多光子聚合的新方法。此种方法能够制备具有高分辨率和高三维可控性的I型胶原蛋白支架，有助于模拟工程组织所需的原生细胞外微环境。因此，将飞秒激光技术应用于rhCol Ⅲ水凝胶的制备，将为其构建高精度细胞培养支架提供新的解决方案。

本文提出一种采用800 nm近红外飞秒激光聚合制备rhCol Ⅲ水凝胶的新方法。利用800 nm近红外飞秒激光优异的材料穿透能力及超高的加工精度，能够显著提高加工结构的复杂程度。首先研究了线层间距、激光功率和扫描速度对rhCol III水凝胶聚合成型结构的影响；进而通过调控加工参数，实现任意复杂图案微结构的制备。实验结果表明，该方法可制备不同孔径和面积的rhCol III水凝胶支架，展现了该技术在细胞培养精密调控研究中的应用价值。

重组Ⅲ型人源化胶原蛋白（rhCol Ⅲ，冻干粉末）和光敏剂亚甲基蓝（MB，分析纯）用于制备水凝胶前体溶液。将rhCol Ⅲ溶解于磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.5，20×，通过超纯水稀释20倍制得），使其最终浓度为300 mg·mL⁻¹，同时将MB添加至溶液中，使MB质量浓度达到4 mg·mL⁻¹。为确保混合溶液中各组分充分溶解，使用磁力搅拌器搅拌10 h。最终将配制成的rhCol Ⅲ水凝胶−MB光敏剂前体溶液储存在4 ℃避光环境中，以防止光照对光敏剂产生影响。

rhCol Ⅲ水凝胶−MB光敏剂前体溶液通过针头滴加在盖玻片上，并使用胶水围成一个方形边界使其固定，且前体溶液的厚度应大于所加工微结构的厚度。在透明盖玻片上，利用飞秒激光直写技术可将rhCol Ⅲ水凝胶−MB光敏剂前体溶液聚合固化为微结构。实验使用的飞秒激光直写加工系统如图1所示。飞秒激光系统的光源采用Spectra-physics的钛蓝宝石飞秒激光器，其输出中心波长为800 nm，脉冲宽度约120 fs，重复频率为80 MHz。激光束经扩束镜扩展以获得均匀分布的光束，并在扩束镜后放置光阑以滤除光束边缘的低质量光。飞秒激光进入振镜扫描系统，能够实现二维平面扫描，通过结合Z轴压电平台和移动载物台，组合完成三维加工。激光经振镜后通过4f系统投射至物镜（Olympus，60×，oil，NA = 1.42）入瞳处，其中使用800 nm专用介质反射镜反射飞秒激光，而照明光可透过并传送至CCD监视器进行实时观察。所需的结构模型可用Solidwork进行设计，再将结构转换为坐标数据后导入加工软件中进行加工。加工完成后，通过光学显微镜（Zeiss Imager.M2）和共聚焦显微镜（Nikon A1+）对制备的水凝胶微结构进行表征。

图 1

Figure 1

图 1 飞秒激光加工系统的实验装置示意图 Figure 1 Schematic diagram of experimental setup for femtosecond laser processing system

采用飞秒激光非线性光刻技术对rhCol Ⅲ水凝胶−MB光敏剂前体溶液进行加工，使其能够聚合成型为任意复杂精细结构。加工过程中，激光功率、扫描速度、层间距和线间距都是影响加工质量的关键参数。通过优化这些参数，探索了最佳的加工条件，以确保最终微结构的精度和复现性符合要求。首先，调节层间距和线间距，以优化结构的精度和加工效率。较小的线层间距会显著增加扫描点数量，延长总加工时间，而过大的线层间距则会降低结构的加工精度，影响最终结构的成型完整性和表面质量。如图2所示，加工了4组具有不同线间距和层间距的圆形微结构。实验结果表明，当线间距为100 nm且层间距为100 nm或200 nm时，制备结构均呈现出较优的形貌特征。综合加工效率和成形精度的平衡考量，最终优选线间距100 nm与层间距200 nm的参数组合作为最优工艺参数组合，用于后续实验研究。

图 2

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图 2 飞秒激光加工rhCol III水凝胶结构的线、层间距探索 Figure 2 Investigation of line and layer spacing in femtosecond laser processing of rhCol III hydrogel structures

确定了合适的层间距和线间距后，进一步优化了激光功率和扫描速度这两个关键参数。激光功率代表了激光的强度，而扫描速度则决定了激光焦点在材料上的运动速度，即每个单点停留的时间。较高的激光功率和较慢的扫描速度会增加交联程度，而较低的激光功率和较快的扫描速度则会导致交联程度不足，影响结构的稳定性和加工精度。为了优化这些参数，通过调节光路中的衰减片和扫描振镜，寻找最适宜的激光功率和扫描速度的组合。在实验中将激光功率范围设置为7.5～20 mW，扫描速度范围设置为50～400 μm/s，如图3所示。实验结果表明，当激光功率范围为10～17.5 mW，扫描速度范围为100～350 μm/s时，所加工的微结构质量最佳。此时，rhCol Ⅲ水凝胶的交联程度适中，既能够确保显影后的微结构拥有足够的机械强度和稳定性，同时也不会因为过度曝光导致水凝胶溶液因热效应产生气泡而造成结构损坏。

图 3

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图 3 飞秒激光加工rhCol III水凝胶结构的激光功率和扫描速度的探索 Figure 3 Investigating the effects of laser power and scanning speed on femtosecond laser processing of rhCol III hydrogel structures

加工软件控制系统在完成单层结构加工后，压电平台向下一加工位置移动的过程中需关闭电快门以阻断激光。加工系统受限于电快门的响应时间，在层间切换时会导致微结构跳点区域的曝光时长增加，进而影响结构形貌的完整性。该现象会随着扫描速度的提升而显著加剧，尤其在加工较大尺寸结构时更为明显。为消除该工艺缺陷对成型质量的影响，后续实验中，通过降低扫描速度优化加工参数，确保了微结构轮廓的精确性和表面形貌的美观度。采用功率12.5 mW、扫描速度100 μm/s、线间距100 nm、层间距200 nm的加工参数对rhCol Ⅲ水凝胶进行加工，成功制备出4种不同的复杂微结构图案。加工完成显影后的微结构形貌如图4所示，其中图4（a）～（d）为光学显微镜观察图，图4（e）～（h）为共聚焦显微镜观察图。显微镜图像清晰展示了微结构的复杂形态，这表明飞秒激光技术具有将rhCol Ⅲ水凝胶制成高分辨率、复杂图案微结构的能力，同时也能够满足高精度细胞培养对培养支架形态和尺寸控制的严苛要求。

图 4

Figure 4

图 4 飞秒激光加工rhCol III水凝胶制成复杂微图案结构 Figure 4 Femtosecond laser processing rhCol III hydrogel to produce complex micro pattern structure

接下来将rhCol Ⅲ水凝胶−MB光敏剂前体溶液聚合加工成4种不同孔径的支架阵列。加工参数设定为：激光功率12.5 mW、扫描速度100 μm/s、线间距100 nm、层间距200 nm、层数25层，并在细胞爬片上完成加工。实验参数优化表明：12.5 mW的激光功率与100 μm/s的扫描速度组合可在确保支架结构完整性的前提下有效缩短加工时间；100 nm线间距保障了亚微米级的加工精度，而200 nm层间距的设置提高了加工效率。通过光学显微镜和共聚焦显微镜均可对加工完成并显影后的rhCol Ⅲ水凝胶支架阵列进行表征，结果如图5所示。其中图5（a）～（d）为光学显微镜成像，图5（e）～（h）为共聚焦显微镜成像，分别对应孔径为10，20，30 和40 μm的支架。

图 5

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图 5 不同孔径的rhCol III水凝胶支架阵列 Figure 5 Arrays of rhCol III hydrogel scaffolds with different pore sizes

加工时间随支架孔径的增大呈等比例线性增加，其对应数据关系如表1所示。这主要是由于较大的孔径需要更广的加工区域和更长的激光扫描路径，从而增加加工时间。此外，线性增长关系证实了飞秒激光加工系统对加工参数的精准控制和运动定位的高重复性，这为复杂结构的可复现性制造提供保障。实验结果表明，图5中支架阵列结构完整且精密，体现出飞秒激光加工rhCol Ⅲ水凝胶支架具有高精度和良好可选择性的优势。值得注意的是，图5（b）中第一个支架底部结构在显影后出现弯曲现象，这可能是由于细胞爬片在压电平台上放置不够水平，导致加工第一层结构时，部分区域的激光焦点略高于细胞爬片上表面，使得聚合成型结构与细胞爬片贴附不牢，最终显影后结构出现松动弯曲。不同孔径的水凝胶支架可对细胞的黏附、增殖、迁移、分化等行为产生不同的影响^[22]。大孔径水凝胶支架提供更充足的空间和营养物质传输通道，有助于细胞分化和成熟；而小孔径水凝胶支架可提供更为稳定的结构空间，促进细胞稳定排列与功能实现^[23]。

表 1 (Table 1)

表 1 不同孔径宽度rhCol Ⅲ水凝胶支架的加工时间 Table 1 Processing time of rhCol Ⅲ hydrogel scaffolds with different pore diameters 支架孔径宽度/μm 10 20 30 40 加工时间/min 28 56 84 112

表 1 不同孔径宽度rhCol Ⅲ水凝胶支架的加工时间 Table 1 Processing time of rhCol Ⅲ hydrogel scaffolds with different pore diameters

水凝胶支架的面积也会对细胞的附着、增殖、分布及细胞间的信号交流产生影响^[24]。因此，使用激光功率为15 mW、扫描速度为100 μm/s的加工参数，制备了3种不同面积的rhCol Ⅲ水凝胶支架，如图6所示。这3种支架的整体尺寸均为45 μm×45 μm，通过调节内部孔径的大小来实现不同面积的支架。其中图6（a）和（d）中支架的面积为1241 μm²（支架的孔径为14 μm），图6（b）和（e）中支架的面积为1001μm²（支架的孔径为16 μm），图6（c）和（f）中支架的面积为729 μm²（支架的孔径为18 μm），支架最小宽度约为3 μm，最大宽度约为5.6 μm。对于不同面积的支架，加工时间同样随着面积的增大而增加，如表2所示。因为支架面积较大程度上影响加工时间，所以支架面积的选取需要综合考虑实验目的、细胞培养规模以及加工效率等众多因素。如果实验对细胞培养的规模和复杂性要求较高，可以选择较大面积的支架，但加工时间较长；如果实验更注重快速筛选或初步研究，较小面积的支架可能更为合适，这可以提高实验效率。图6（a）～（c）和图6（d）～（f）分别展示了3种不同面积支架加工显影后在光学显微镜和共聚焦显微镜下的成像结果。通过制备具有不同孔径和面积的高精度rhCol Ⅲ水凝胶支架结构，可为后续如何利用rhCol Ⅲ水凝胶支架精确引导细胞的生长、黏附和分化的研究奠定基础，这也为rhCol Ⅲ水凝胶在细胞培养领域的应用探索提供了新思路和新方法。

图 6

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图 6 不同面积的rhCol III水凝胶支架 Figure 6 Hydrogel scaffolds with different areas composed of rhCol III

表 2 (Table 2)

表 2 不同面积rhCol III水凝胶支架的加工时间 Table 2 Processing time of rhCol III hydrogel scaffolds with different surface areas 支架面积/μm2 729 1001 1241 加工时间/min 41 60 72

表 2 不同面积rhCol III水凝胶支架的加工时间 Table 2 Processing time of rhCol III hydrogel scaffolds with different surface areas

本研究基于飞秒激光技术，成功开发了800 nm近红外飞秒激光聚合制备rhCol Ⅲ水凝胶微结构的新方法。探索了最适宜rhCol Ⅲ水凝胶加工的激光功率和扫描速度，这可以在避免聚合过度和热损伤的同时保证形成均匀稳定的微结构。此外，通过对线间距和层间距的优化，进一步提高了成型结构的精度和加工效率。选取合适的加工参数，将rhCol Ⅲ水凝胶聚合加工成4种复杂精密图案微结构，并为后续细胞培养实验加工出具有高精度、可自由设计的支架结构阵列，支架最小宽度可达3 μm。实验结果显示，采用此技术制备的rhCol Ⅲ水凝胶支架具有优良的结构稳定性和较高的加工精度，能够满足细胞培养的需求。总体而言，飞秒激光技术在rhCol Ⅲ水凝胶精密支架的制备方面展现出强大的应用潜力，特别是在细胞培养和组织工程领域具有广阔的发展前景。