随着发病率不断上升，癌症已成为全球第二大死亡原因。在常见癌症的发病率和死亡率统计中，膀胱癌均位居前列^[1]。膀胱癌的传统治疗方式包括化疗、放疗等，但这往往伴随全身性毒副作用。如何降低肿瘤治疗中的毒副作用一直是医学领域的研究热点。其中，光疗具有高时空可控性，是目前最有潜力的抗癌疗法之一。光疗包括光热疗法和光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）^[2-3]等。

光热疗法所产生的高温会引起蛋白质变性，对细胞造成不可逆的损伤。与正常细胞相比，癌细胞耐高温能力较弱，这使得热处理成为肿瘤治疗的一种途径。早期，单纯激光照射疗法可作为一种肿瘤治疗手段，但其存在损伤正常组织的风险，极大限制了这种疗法在临床上的广泛应用^[4]。因此，诱导局部加热的光热治疗成为肿瘤治疗领域的研究热点。光热剂可吸收特定波长的光并将其转换为热能，进而产生光热效应^[5]。利用光热剂在肿瘤部位的聚集，可以选择性地在病灶处产生热量，而不会影响癌旁组织。在光波长选择方面，近红外光（near infrared，NIR）因其组织散射较低，可穿透深层组织，且组织中的水及生物分子对NIR的吸收弱，对组织造成的损伤极低，因此成为肿瘤光疗中的首选光源^[6-10]。据报道，包括金属纳米粒子、碳纳米材料和黑磷在内的多种纳米材料，因其在NIR波段具有良好的光热效应，且在肿瘤中具备被动靶向性，使其成为优异的光疗候选材料。其中，吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）基纳米材料以卓越的光热转换效率，以及优异的近红外光穿透能力，成为光热治疗的热门纳米材料。

PDT通过光照射光敏纳米材料产生活性氧物质（reactive oxygen species，ROS），实现肿瘤治疗。ROS可诱导线粒体氧化应激，并通过凋亡、坏死性凋亡、焦亡等信号通路介导，最终导致肿瘤细胞死亡。Zhang等^[11]制备了一种上转换沸石基纳米复合材料，其可在NIR及超声作用下产生大量的ROS，最终导致细胞凋亡。Huang等^[12]设计了具有高密度Cu₂O支撑的MoS₂纳米花，使用NIR操纵纳米药物，在肿瘤部位将过氧化氢（H₂O₂）快速转化为ROS，有效预削弱了癌细胞的多重抗氧化系统，形成强烈的ROS风暴，最终导致细胞死亡。此外，Peng等^[13]使用空心结构框架，与铁和DSPE–PEG2000配位，在808 nm NIR的活化下，通过$ {\mathrm{O}}_2^- $、·OH、¹O₂等活性氧物质，诱导细胞铁死亡。作为美国食品药品监督管理局唯一批准的，可用于临床诊断的近红外荧光染料，ICG具有优异的光动力性能^[14]，但其在水溶液中的不稳定性及在血浆中的快速清除率限制了它的临床应用。铋（Bi）是一种毒性极低的金属元素^[15]，为铋基材料在肿瘤治疗中的应用提供了生物安全保障。BiF₃是一种介孔纳米材料^[16]，疏松多孔的物理特性使其成为优异的药物载体。同时，BiF₃具备良好的水分散性和稳定性，使得负载ICG的BiF₃纳米材料有望突破ICG在临床应用中的限制。

本研究成功设计并合成了负载ICG的BiF₃介孔纳米球（BFPI），其外观呈深绿色，在NIR波段中具有优异的光热转换效率及ROS生成能力。实验证明：在NIR照射下，BFPI具有高效杀伤肿瘤细胞的能力；通过对比光疗前后肿瘤细胞的形貌，发现BFPI介导的光疗可导致膀胱癌细胞产生明显焦亡。BFPI作为一种新型纳米材料，为膀胱癌的光疗研究提供了一种新的有效策略。

1 实验部分 1.1 载药材料的制备

本研究使用介孔BiF₃纳米球负载光敏剂ICG，并经PVP修饰，合成一种新型载药纳米材料BFPI。以下为具体的实验材料和合成步骤。

1）实验材料

五水硝酸铋（99.9%）、九水硝酸钠（≥98%）、乙二醇（EG，99%）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30，分子量45 000～58 000）购自上海化学试剂（中国）。硝酸钠（99.9%）和氟化铵（99.99%）购自安道麦斯（中国）。吲哚菁绿（ICG）购买自MedChemexpress（中国）。甲醇（99%，分析纯）购买自中国医药集团有限公司。所有试剂未经过进一步纯化，纯度均用质量分数表示。

2）BiF₃的制备

取1 mmol五水合硝酸铋，2 mmol硝酸钠和400 mg PVP K30置于20 mL 乙二醇中，充分搅拌（500 r/min）1 h，快速加入氟化铵（2 mL，74 mg/mL溶于15 mL 乙二醇溶液），室温搅拌60 s，最后加入35 mL去离子水终止反应。随后，立即洗涤3次，去除杂质。接着，使用去离子水分散BiF₃颗粒，4 ℃避光保存。

3）BFPI的制备

取BiF₃和ICG（质量比4∶1）分散于甲醇溶液，加入PVP K30（质量为BiF₃和ICG总量的4倍）充分搅拌（500 r/min）24 h，再离心（10 000 r/min）10 min，洗涤两次，最后使用去离子水分散纳米颗粒，4 ℃避光保存。

1.2 材料的形貌表征

取适量BFPI溶液滴加在铜网上，液滴成半球状，使用加热灯干燥样品。采用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）进行BFPI的形貌表征。采用纳米粒径分析仪，进行材料的水合粒径测试。

1.3 材料的性能表征

分别测试了BFPI的光热性能和光动力性能。

1）光热性能

使用热成像仪（FLIRE E40，美国）检测BFPI水溶液在808 nm光照射下的光热特性。通过调整照射功率密度（从0.6 W/cm²增至1.2 W/cm²），来监测温度，然后关闭激光器，每次测试5 min。

2）光动力性能

使用1，3–二苯基异苯并呋喃（溶于DMSO）作为指示剂，取0.1 mg/mL的BFPI溶剂3 mL，用照射功率密度为1 W/cm²的激光照射，每隔2 min读取一次材料吸收光谱，共测试10 min。作为对照，采用相同操作，对纯水进行测试。

1.4 细胞培养

本文实验对象为小鼠膀胱癌细胞（MB49），使用含10%（体积分数）胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、CO₂（体积分数5%）培养箱中恒温培养。

1.5 细胞摄取实验

采用共聚焦小皿培养MB49细胞，在恒温培养箱中放置24 h，分别于实验前2 h、6 h、12 h将DMEM培养基置换为含0.1 mg/mL的BFPI溶液（溶剂为DMEM培养基），利用共聚焦显微镜观察细胞对纳米材料的摄取情况。

1.6 CCK8实验

采用96孔板培养MB49细胞，在37 ℃培养箱中放置24 h后，分别加入经DMEM稀释，质量浓度分别为50、100、150、200 μg/mL的BFPI溶液。24 h后，采用酶标仪测量每个孔在450 nm波长处的吸光度（OD值），得到材料的暗毒性。重复上述加样步骤，24 h后，使用照射功率密度为1 W/cm²的激光照射每个孔5 min，再用酶标仪测量每孔的OD值，得到材料的光毒性。

1.7 细胞存活性染色

采用共聚焦小皿培养MB49细胞，24 h后，分别加入经DMEM稀释的0.2 mg/mL的BFPI溶液和BiF₃溶液，12 h后，使用照射功率密度为1 W/cm²的激光照射MB49细胞10 min。根据是否采用光照，将细胞分为光照和非光照两大组，各大组又细分为空白组、BiF₃组和BFPI组。24 h后，各组细胞均与Calcein-AM和PI避光共孵育15 min。随后，用PBS洗涤细胞，并采用共聚焦显微镜监测细胞内荧光（Calcein-AM为绿色，PI为红色）情况。

1.8 DCFH-DA染色

采用共聚焦小皿培养MB49细胞，同样将细胞分为光照和非光照两大组，各大组又细分为空白组、BiF₃组和BFPI组。光照组采用照射功率密度为1 W/cm²的激光照射10 min后，再与DCFH-DA探针在黑暗中共孵育20 min。PBS洗涤2遍后，采用共聚焦显微镜观察细胞中的荧光（激发光为蓝光，发射光为绿光）情况。

1.9 细胞焦亡形貌表征

采用共聚焦小皿培养MB49细胞，24 h后，加入用DMEM稀释的0.2 mg/mL的BFPI溶液，12 h后使用照射功率密度为1 W/cm²的激光照射MB49细胞10 min。30 min后，采用荧光显微镜拍摄明场的细胞形貌。

2 结果与讨论 2.1 BFPI的形态表征

载药材料合成后，首先测试其形态表征，图1（a）为载药材料BFPI的TEM图像。可观察到，BFPI纳米材料呈多孔荔枝状，形貌均一，其平均尺寸约为280 nm。图1（b）是BFPI溶液在比色皿中的图像，整体表现为深绿色，无沉淀，分散性良好，表明BFPI的水溶性好。BiF₃负载ICG有效改良了ICG的有机溶剂依赖性，无需DMSO等有机溶剂助溶，有效减低了因有机溶剂引入而导致的毒性。图1（c）所示为BFPI的水合粒径表征结果，其平均粒径约为320 nm。该纳米尺寸可使材料滞留在肿瘤内部，从而实现持续给药。由此可见，PVP修饰的介孔BiF₃纳米球负载ICG符合实验预期。

2.2 BFPI的光热性能

为了验证BFPI纳米材料的光热性能，首先使用热成像仪对不同功率激光照射后BFPI纳米材料的升温情况进行表征。图2（a）为不同激光功率下，纳米材料在5 min内的升温曲线。可以看到，相同照射时长下，温度随光照功率的增大而升高。当功率密度为1 W/cm²时，BFPI纳米材料从室温25 ℃升高至45 ℃以上，能较好地实现癌细胞杀伤效果。图2（b）是光热性能的热图，结果显示纳米材料表现出优异的光热性能。

2.3 BFPI的光动力性能

为了验证BFPI的光动力效果，采用1，3–二苯基异苯并呋喃（DPBF）荧光探针探究BFPI的光动力性能。DPBF可以和单线态氧（¹O₂）结合，过程不可逆，产物的紫外可见吸收峰位于400～450 nm。

图3（a）所示为，BFPI溶液在激光功率密度为1 W/cm²时DPBF的降解情况。在426 nm处，10 min时的OD值较初始数值下降明显，表明BFPI在808 nm波长激发下产生了大量的活性氧。活性氧能破坏肿瘤细胞的蛋白质、脂质和核酸结构，进而导致细胞死亡。图3（b）所示为对照组（水）的DPBF降解曲线，各时间点的OD值无明显下降。综上可知，BFPI的光动力性能优异。

2.4 BFPI的细胞摄取情况

为检验负载BFPI能否进入肿瘤细胞并发挥相应效应，借助共聚焦显微镜观察了MB49细胞对BFPI的摄取情况。图4中红色区域所示为BFPI的分布。与明场图像对比可知，MB49细胞对BFPI的吞噬效果良好，与BFPI溶液共孵育2 h后，即可在MB49细胞中检测到BFPI的分布，且该材料能在细胞内稳定存留达12 h。这表明所制备的负载材料BFPI的生物相容性良好，能在细胞内维持稳定性能，且MB49细胞对BFPI的摄取效果显著。

2.5 细胞毒性实验

CCK-8试剂盒通过特定反应物的颜色深浅来指示活细胞数量，颜色越深表明活细胞越多。该方法常被用来评估细胞活性，且灵敏度高。图5（a）和（b）展示了不同BFPI浓度下MB49细胞的光毒性和暗毒性情况。在未受激光照射时，MB49细胞存活率维持在80%以上；经808 nm波长光激发后，BFPI能显著杀伤癌细胞，当其质量浓度达到0.2 mg/mL时，MB49细胞的存活率降至25%左右。该结果在一定程度上证实了BFPI借助光热与光动力效果能有效杀伤MB49细胞。为了验证BFPI负载体系的安全性和有效性，检测了其对正常细胞HPAEpiC的暗毒性，结果如图5（c）所示。结果表明，BFPI负载体系能进入非癌细胞HPAEpiC，且细胞存活率高达85%以上。

2.6 膀胱癌细胞存活性研究

Calcein-AM常与死细胞荧光探针碘化丙啶（PI）联用，可实现活细胞与死细胞的双重荧光染色，用以判断细胞存活性。如图6（a）和（b）所示：未受光照的样本中，红色荧光几乎不可见，而绿色荧光较为明显，反映出BiF₃和BFPI等纳米材料具有优良的生物安全性；在光照条件下，光照组与BiF₃组细胞维持良好生存状态，主要呈现绿色荧光，而BFPI组红色荧光最强，表明该组有大量细胞死亡。该实验结果有力证实了，经808 nm激光激发的BFPI材料能够高效杀伤膀胱癌细胞，该结果与采用CCK-8试剂盒检测所得结果一致。

2.7 BFPI产生ROS能力的研究

为了在细胞层面验证纳米材料BFPI生成ROS的能力，采用DCFH-DA纳米探针来探究不同组别MB49细胞内部ROS的水平。DCFH-DA无荧光，可穿过细胞膜，在细胞内被酯酶水解为DCFH。细胞内有ROS存在时，DCFH被氧化为强荧光的DCF，且荧光强度与ROS水平正相关，从而可间接测量细胞内ROS的产生量。

图7（a）和（b）所示为MB49细胞摄取BFPI后，在非光照和光照条件下不同组别的ROS产生情况。非光照组的绿色荧光较弱，表明几乎没有ROS的产生。而光照组中，Control组和BiF₃组实验结果与非光照组一致，但BFPI组的荧光亮度远高于其他两组，表明该组产生了较多ROS。由此说明，BFPI具备出色的ROS生成能力。

2.8 细胞焦亡形貌表征

借助荧光显微镜的明场观察法，评估了BFPI介导的光疗诱导MB49细胞死亡的方式。如图8（a）所示，在明场中可观察到MB49细胞在形态上出现显著变化，包括细胞肿胀、细胞坍塌破裂以及呈气球样变等现象，与细胞经典的焦亡形貌一致。测量不同处理条件下MB49细胞培养上清液中IL-1β的含量，结果见图8（b）。BFPI+光照组的IL-1β表达量相对其他组较高，说明BFPI+光照组的处理方式能够导致炎性因子IL-1β的成熟与分泌，诱导MB49细胞焦亡。综上所述，经808 nm激光照射，BFPI能够有效诱导MB49细胞发生焦亡。

3 结　论

本研究以传统光敏剂ICG为基础，借助介孔BiF₃纳米球负载，成功解决了ICG对有机溶剂的依赖问题，使负载体系在水环境中均匀分布。光热与光动力性能测试表明，该纳米体系具备出色的光热效能及活性氧生成能力。细胞摄取实验证实了BFPI在MB49细胞内具有良好的生物相容性和细胞稳定性。CCK-8试剂盒、Calcein-AM及PI细胞染色结果显示，在808 nm波长激发下，BFPI对MB49细胞展现出较强的杀伤力。利用荧光显微镜观察发现，MB49细胞膜出现肿胀、气球样变等焦亡特征，表明BFPI能在近红外区域有效诱导膀胱癌细胞焦亡。该研究成果表明，BFP能在短时间内发挥效用，显著杀伤MB49细胞，有望在膀胱癌治疗领域发挥重要作用。