多巴胺(dopamine,DA)在中枢神经系统中扮演着关键角色,它在中枢神经系统细胞外液中的浓度为10 nmol/L~1 μmol/L[1]。它的消耗或缺乏与诸多生理和心理疾病紧密相关,如帕金森病、精神分裂症和亨廷顿病[2-3]。因此,对生物样本中的多巴胺进行高灵敏与高选择性的检测,对揭示其生物学功能,以及上述疾病的精准诊断具有重要意义[4]。目前,各种高灵敏检测技术,包括荧光[5]、发光[6]、色谱[7]、电化学[8-9]等已被开发出来。尽管这些技术在生物分子DA的检测中得到了广泛应用,但它们常常面临样品预处理繁琐、设备成本高、操作条件苛刻和依赖专业培训的操作人员等缺点。此外,检测分析过程耗时较长也不利于大批量样本的实时在线监测[5-9]。由于生物体内DA浓度极低,开发一种无需样品预处理,且灵敏度高、快速、特异性的检测方法对于神经系统疾病的预防和诊治具有重要的研究意义。
表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)技术以其高灵敏度和获取分子指纹信息的能力,被证明是检测低浓度下DA及其衍生物的一个有效替代方案。自1974年在粗糙银电极表面首次发现以来,SERS技术受到了广泛关注[10]。SERS的增强机制通常包括电磁增强机制(electromagnetic enhancement mechanism,EM)和化学增强机制(chemical enhancement mechanism,CM)两种[11]。其中,EM主要源自SERS衬底表面的表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)现象[11]。贵金属纳米材料(如Au和Ag)具有卓越的局部表面等离子体共振(localized surface plasmon resonance,LSPR)效应,成为SERS领域中最常用的材料之一[12]。然而,纯贵金属SERS衬底在稳定性和生物相容性方面表现不佳,从而限制了其在生物分子检测中的应用[13]。同时,一些基于电荷转移(charge transfer,CT)机制的半导体材料在SERS效应方面表现出优越的生物相容性和稳定性,在生物分子检测领域展现出极大潜力[14]。
二维过渡金属碳化物和/或氮化物(MXenes)是一种新型的类石墨烯二维(2D)材料,因其独特的亲水性、生物相容性、电导性及稳定性,在超级电容器、电池、传感器和医药等领域受到了广泛关注[14-15]。当与贵金属纳米材料耦合时,这种复合材料能够显著增强EM效应,展现出强大的SERS性能[16]。尽管静电组装策略能通过超灵敏的等离子体耦合精准控制等离子体的强弱,但MXene与等离子体之间的静电作用较弱。在原位生长策略中,MXene能够在未添加任何还原剂的情况下,将金属阳离子化学还原为金属纳米颗粒,将等离子体纳米颗粒固定在其表面[17]。然而,MXene表面原有的还原位点较少,导致组装在MXene表面的金属粒子的间距和颗粒尺寸较大,从而使其SERS性能显著下降[18]。
为了解决这一难题,通过碱化过程在Ti3C2Tx膜表面构建了具有最大耦合的等离子体超表面,并调控了膜表面银纳米粒子(silver nanoparticles,AgNPs)的负载量。首先,通过化学蚀刻法制备碳化钛(Ti3C2Tx)MXene少层分散液;随后,采用真空辅助过滤法制备出具有良好韧性的柔性Ti3C2Tx膜;接着,对Ti3C2Tx薄膜碱化处理,使其表面羟基化,从而为AgNO3提供更多的还原位点[18]。通过调控AgNPs在薄膜上的负载量,最终得到高性能的Ag@Ti3C2-OH薄膜。与Ag@Ti3C2Tx相比,Ag@Ti3C2-OH膜的拉曼信号强度增强了5倍。DA分子能够通过自身的羟基基团与Ti3C2Tx膜上剩余的羟基基团形成氢键。随着AgNPs在MXene薄膜上的逐渐生长,其负载量不断增加且粒间间隙减小,使得拉曼信号显著增强。因此,推测Ag@Ti3C2Tx对生物分子DA具有较强的SERS效应,为深入探究其在生物物质检测领域的应用潜力提供了新的思路。
1 实验部分 1.1 单层Ti3C2Tx纳米片的制备图1(a)展示了Ti3C2Tx纳米片的制备原理。首先,将2 g氟化锂缓慢加入到40 mL浓度为9 mol/L的盐酸(HCl)中,并持续搅拌10 min保证其完全溶解;随后,缓慢加入1 g Ti3AlC2,35 ℃下搅拌48 h,完成蚀刻;接着,用HCl(1 mol/L)洗涤两次,去除多余的氟化锂;然后,用去离子水多次离心洗涤含有HCl的多层Ti3C2Tx,转速为3 500 r/min(离心半径5 cm),每次离心时间为5 min,直至洗涤液的pH>6;再然后,将沉淀物重新分散在100 mL水中进行2 h的超声处理;最后,在3 500 r/min(离心半径5cm)的转速下离心30 min后,收集上清液备用。
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图 1 Ti3C2Tx 的制备与表征 Figure 1 Preparation and characterization of Ti3C2Tx |
利用真空辅助过滤法制备了柔性Ti3C2Tx膜[17]。首先,取10 mL配制好的Ti3C2Tx分散液的上清液,用孔径为0.22 μm的水系微孔滤膜过滤;然后,将水系微孔滤膜放置在40 ℃的真空干燥箱中进行2 h的干燥处理;最后,将Ti3C2Tx膜从干燥完成后的水系微孔滤膜上剥离。
1.3 柔性Ti3C2Tx膜碱化及Ag@Ti3C2-OH基底的制备先将Ti3C2Tx膜浸泡在氢氧化钠溶液(5 mol/L)中,持续反应5 h进行碱化处理,获得Ti3C2-OH膜[17]。然后,用去离子水冲洗膜,彻底除去残留物。接着采用原位还原法[18]将Ti3C2-OH膜分别在0.1 mmol/L的AgNO3溶液中浸泡3、6、9、12和15 min,并在每个时间点后用去离子水进行多次冲洗,以去除未反应的银离子。最后,将样品置于60 ℃的真空干燥箱中干燥2 h,得到Ag@Ti3C2-OH膜。
1.4 SERS检测拉曼及SERS光谱采用台式拉曼光谱仪进行测试,激发波长为532 nm,激光功率为1 mW,单谱采集时间为1 s。将Ag@Ti3C2-OH膜浸泡在DA溶液中5 min,使DA分子与AgNPs@Ti3C2-OH膜充分结合。通过场发射扫描电镜(scanning electron microscope,SEM),型号Quanta FEG 250,观察样品的结构形貌。使用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM),型号VIS–nesSCOPE,测量Ti3C2Tx纳米片的厚度。
2 结果和讨论如图1(b)所示,在化学蚀刻后得到的多层Ti3C2Tx MXene结构的SEM图像中,可以清晰地看到Al被蚀刻后的Ti3C2Tx 层状结构。为了制备柔性MXene膜,对Ti3C2Tx胶体溶液进行了进一步的超声分层处理。图1(c)展示了通过AFM测量获得的Ti3C2Tx纳米片图像,沿着黄色线条位置测定的纳米片厚度为1.97 nm,验证了纳米片的成功分层。所制备的柔性Ti3C2Tx膜易于对目标分子进行采样,极大提高了其在SERS等领域的实际应用潜力。采用真空辅助过滤法,成功制备了一系列独立的Ti3C2Tx膜,如图1(d)光学图像所示,可以清晰地看到Ti3C2Tx膜呈现出金属光泽,具有优异的韧性,并且少层Ti3C2Tx分散液也具有良好的分散性。
图2(a)为前驱体Ti3AlC2及其蚀刻后产物Ti3C2Tx的拉曼光谱对比。在去除铝层后,原本存在于Ti3AlC2中的182 cm−1 [E1g(Ti,C)]、200 cm−1 [E2g(Ti,Al,C)]和270 cm−1 [A1g(Ti,C)]处的拉曼峰值消失,而631 cm−1和648 cm−1处峰变宽并发生偏移[19],这表明Ti3C2Tx MXene纳米片成功分层。根据Hu等[20]的模拟计算结果:126 cm−1处的峰主要是由Ti3C2F2表面Ti原子平面内振动产生;208.2 cm−1和724.3 cm−1处的峰分别由Ti3C2O2表面的Ti和C原子的拉伸振动引起;290.0 cm−1和634.4 cm−1处的峰对应于Ti3C2(OH)2的中H和C原子平面内振动;384.0 cm−1处的峰是由O原子的平面内振动产生。图2(b)中X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)模式清楚显示,Ti3AlC2衍射峰的完全消失。如没有(104)峰,则表明铝元素的选择性去除。此外,MXene的特征峰(002)峰的左偏,表明Ti3C2Tx MXene的层状堆积高度有序[21]。两个在7°和18.5°处观察到的XRD峰分别对应于Ti3C2Tx的(002)和(004)晶面,进一步证实了材料为层状结构[22]。
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图 2 前驱体 Ti3AlC2和 Ti3C2Tx 的表征 Figure 2 Characterization of precursors Ti3AlC2 and Ti3C2Tx |
在MXene纳米片中,由于-F和=O基团的费米能级(EF)较低,它们难以有效提供电子。而-OH基团作为贵金属粒子的还原位点,在MXene表面末端官能团中仅占约25%,剩余的大部分表面末端官能团都是不具有还原性的-F和=O基团[17-18]。这导致了MXene表面被还原的等离子体金属纳米粒子之间的间距过大,不利于等离子体耦合以及SERS性能的表现[22]。针对这一问题,采取了碱化处理方式来优化Ti3C2Tx膜表面的官能团结构,以增加其表面-OH基团的数量,详见图3。
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图 3 MXene 膜的碱化及 AgNPs 组装的原理 Figure 3 The principle of alkalization of MXene films and assembly of AgNPs |
未处理和碱化处理后的MXene薄膜的拉曼光谱如图4(a)所示。碱化处理后,MXene薄膜在208.2 cm−1及724.3 cm−1处的拉曼峰分别蓝移至213.8 cm−1和735.6 cm−1,这表明Ti和C原子的平面内及平面外振动强度增加。受碱化的影响,292.5 cm−1、384.0 cm−1和634.4 cm−1处的特征峰发生红移,表明碱化后Ti-OH键相较于Ti-F和Ti=O的强度较弱,从而导致化学键的振动频率下降。另一种可能的情况是,表面的-OH基团与溶液中的水分子形成了氢键,削弱了-OH基团的键合力,导致Ti-OH键的振动频率降低。
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图 4 不同 Ti3C2Tx 基底及其 SERS 性能的表征 Figure 4 Characterization of different Ti3C2Tx substrates and their SERS properties |
图4(b)和(c)分别展示了未处理和碱化处理后的MXene薄膜上组装的AgNPs的SEM图像。可以明显看到,未处理的MXene薄膜上AgNPs尺寸较大且分布稀疏;碱化处理后的MXene膜上的AgNPs尺寸较小且分布密集,更有利于增强基底的SERS性能。因此,选择使用碱化处理后的MXene薄膜作为负载AgNPs的SERS衬底。图4(d)展示了利用Ag@MXene实现SERS增强的一种可能机制[23]。其中-OH之间的脱水缩合作用[24]促使DA分子通过自身的-OH紧密吸附于富含-OH官能团的MXene纳米片表面。随后,AgNPs的EM效应促使吸附的DA分子产生强烈的拉曼信号。在此过程中,MXene纳米片可能通过以下几种方式发挥作用,以增强SERS效能[23]:1)MXene纳米片良好的导电性能[13]促进了AgNPs之间的有效耦合,形成了更大的局域电场;2)MXene纳米片具有丰富的吸附位点,不仅使AgNPs紧密排列,而且也富集了大量的DA分子,有利于产生强的拉曼信号;3)DA分子与MXene纳米片紧密结合,可能进一步加强AgNPs的电磁增强效应。通过比较不同基底(Ti3C2Tx、Ti3C2-OH、Ag@Ti3C2Tx和Ag@Ti3C2-OH)表面所获得的DA拉曼光谱,如图4(e)所示,可以看到Ti3C2-OH的信号强度比Ti3C2Tx的提升了3倍,说明碱化处理在一定程度上提高了基底的探测性能。然而,相较于Ag@Ti3C2Tx,Ag@Ti3C2-OH的拉曼信号强度增强了5倍,表明在碱性处理的MXene膜上形成的密集AgNPs显著提高了基底的SERS性能。综上所述,AgNPs是Ag@Ti3C2-OH中的主要SERS活性成分。虽然MXene纳米片对DA分子的SERS效应增强不明显,但它与AgNPs之间的协同效应增强了对DA的SERS响应[22]。Ag@Ti3C2-OH膜对DA强烈的SERS效应主要归因于MXene纳米片与AgNPs之间的增益协同作用。
AgNPs在MXene薄膜表面的负载量和粒间间隙是调节检测DA拉曼增强性能的关键参数[18]。为此,研究了Ti3C2-OH薄膜上不同负载量的AgNPs衬底对SERS性能的影响。将Ti3C2-OH薄膜置于0.1 mmol/L的AgNO3溶液中反应3~15 min,使AgNPs在其表面生长,并通过SEM观察形貌演变过程,结果如图5(a)所示。随着生长时间的延长,薄膜由黑紫色逐渐变为银白色,表明更多的Ag+被还原成AgNPs,并固定于Ti3C2-OH薄膜表面,如图5(b)和(c)所示。根据上述SEM图像,使用ImageJ图像处理软件统计了AgNPs在薄膜上的颗粒尺寸与覆盖率,并绘制了尺寸分布柱状图与覆盖率线状图。经统计分析得:生长时间从3 min延长至12 min时,AgNPs平均粒径从(60.6±15.9)nm增加到(118.3±26.7) nm,同时颗粒覆盖率也从29.12%增长到72.9%;继续延长生长时间至15 min时,尽管颗粒覆盖率达到了79.9%,但部分颗粒开始聚集形成较大的片状结构,导致颗粒分布均匀性下降,这种变化可能不利于基底的SERS性能。为了验证这一趋势,制备了5种不同生长时间的Ag@Ti3C2-OH薄膜,对10−4 mol/L的DA分子进行SERS检测,结果如图5(d)所示。取1 483 cm-1的拉曼峰的强度作为参照,绘制了5种不同生长时间的Ag@Ti3C2-OH薄膜检测DA(10-4 mol/L)得到的拉曼强度线状图,详见图5(e)。结果表明,当颗粒覆盖率约为72.9%时,DA分子的SERS信号达到峰值,而当颗粒覆盖率达到79.9%及以上时,由于AgNPs颗粒变大且均匀性降低,SERS性能显著衰减。此外,AgNPs数量增加会减少后续组装在Ti3C2-OH薄膜上的DA分子数量,这也成为SERS信号降低的重要原因。综上所述,AgNPs在薄膜上的颗粒覆盖率约为72.9%时形成的Ag@Ti3C2-OH薄膜基底具有最佳的SERS性能,因此后续实验均采用该条件的基底。
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图 5 AgNPs 在 Ti3C2-OH 膜上的分布统计及 Ag@Ti3C2-OH 膜的 SERS 性能表征 Figure 5 Statistical distribution of AgNPs on Ti3C2-OH film and SERS performance characterization of Ag@Ti3C2-OH film |
在Ag@Ti3C2-OH薄膜基底上进一步研究了不同DA浓度下基底的SERS性能,结果如图6(a)所示。光谱中1 483 cm−1处的特征峰(v19b,儿苯二酚环振动)是分辨DA分子的主要标志。此外,其他特征峰如1 269.3 cm−1(vC–O)、1 331 cm−1(v8,C-OH)和1 428 cm−1(v19a,儿茶酚环振动)也直接表明了DA的存在[25]。随着DA浓度的增加,这些特征峰的强度显著增强。当DA浓度低至1×10−9 mol/L时,1 483 cm−1处的拉曼峰依然清晰可见。然而,当DA浓度降至1×10−9 mol/L以下时,其SERS信号变得难以检测,这表明Ag@Ti3C2-OH对DA的最低检测限为1×10−9 mol/L,说明该基底可用于人体多巴胺的痕量检测[1]。如图6(b)所示,1 483 cm−1峰强度与DA浓度对数之间的线性拟合结果(R2=0.995)表明了两者之间具有良好的线性相关性,从而验证了Ag@Ti3C2-OH薄膜作为SERS基底在DA的定性与定量检测中的潜力。为了评估Ag@Ti3C2-OH薄膜在实际应用中的信号重复性,随机选取了20个点进行DA分子的SERS光谱测试。如图6(c)所示,选取DA分子在1 483 cm−1的特征峰作为分析对象,计算得到该特征峰强度的相对标准差(relative standard deviation,RSD)为6.36%。实验数据表明,各检测位点在该特征峰处的SERS信号强度波动较小,其RSD显著低于常规SERS基底的标准差阈值[22]。这一结果充分验证了Ag@Ti3C2-OH薄膜基底的稳定性及其在生物分子检测领域的应用潜力。
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图 6 AgNPs@Ti3C2-OH 基底对 DA 的拉曼表征 Figure 6 The Raman characterization of DA by AgNPs@Ti3C2-OH base |
本研究开发了一种可用于DA检测的SERS薄膜。采用真空过滤和碱化处理方法,在Ti3C2-OH MXene膜上原位生长AgNPs。碱化处理使得MXene膜能够最大程度地组装AgNPs并有效吸附DA分子,从而实现对DA分子的高效检测。通过调控AgNPs在Ti3C2-OH薄膜上的负载量,芯片的检测极限降低至1×10−9 mol/L,低于人体DA正常浓度(10 nmol/L~1 μmol/L)。此外,Ag@Ti3C2-OH薄膜还表现出了良好的信号重复性(RSD 为6.36%)。本研究成果为人体内多巴胺分子的检测提供了一种新的方法,展示了其在生物检测及医疗诊断领域的广阔应用前景。
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