2025, Vol. 47
Issue (4): 76-83
传统的光学显微镜受到光学衍射的限制，其分辨率只能达到阿贝极限（Abbe diffraction limit）d = λ/（2nsinα）。在可见光范围内，该分辨率仅约为200 nm，超出了许多微观体系样品的尺度，无法实现亚衍射级成像。因此，需要考虑更先进的成像技术[1]。
在过去几十年里，研究人员开发了一系列亚衍射级荧光显微镜技术，如受激辐射损耗（stimulated emission depletion microscopy，STED）[2]、结构光照明（structured illumination microscopy，SIM）[3]、随机光学重建（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）[4]等，其精度远超衍射极限，被广泛应用于生物医学、化学和材料科学领域。与传统的光学显微镜和激光共聚焦荧光显微镜相比，这类荧光成像技术精度能达到5 nm以下；与电子显微镜相比，这类荧光成像技术应用范围更广，对样品的性质和形态没有要求，无需复杂的样品制备流程，且能实现彩色成像[5]。可以说，超分辨荧光显微镜将“光学显微镜带入纳米维度”，填补了电子显微镜和共聚焦荧光显微镜之间的空白[6]。
以上这些技术都基于荧光探针吸收特定波长的光并以更长的波长重新发射的特性来实现。为实现更好的成像效果，需要荧光探针具备荧光特性可控、荧光明亮稳定、无毒无损伤的特点。传统上，常采用有机荧光染料[7]或生物荧光基团[8]作为荧光探针，但这些探针存在光稳定性较低、灵敏度不足、荧光特性不可控、会造成漂白损伤等缺陷[7-8]。因此，需要寻找性能更出色的新型荧光探针用于实现亚衍射级成像。
近年来，研究者发现在传统掺氮金刚石的基础上，通过离子注入[9-10]或电子辐照[11]后退火的方法，可以获得一种发光缺陷：氮−空位（nitrogen-vacancy，NV）色心，由氮原子与空穴复合形成，其结构如图1所示[12]。色心具有稳定的发光特性、独特的光学亮暗态转换特性、较长的电子自旋相关时间、生物兼容等特点，可以作为新型量子点荧光探针，在亚衍射级成像领域发挥重要作用[12]。
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图 1 NV色心金刚石晶体结构示意图[12] Figure 1 Schematic diagram of the crystal structure of NV color center diamond |
荧光探针常见的设计机理包括光致电子转移、激发态分子内质子转移、荧光共振能量转移、通过键能量转移、内部电荷转移、扭曲分子内电荷转移和聚集诱导发射[13]。对于氮−空位色心而言，主要的机理包括光致电子转移和荧光共振能量转移。
内部电荷转移是最经典的一种荧光探针发光机理，可以很容易地根据前线轨道理论来解释[13]。如图2所示，NV色心有NV−和NV0两种电荷态，波长为
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图 2 近红外光电离激发态NV−和NV0示意图[14] Figure 2 Schematic diagram of NV− and NV0 in the excited states of near-infrared photoionization |
荧光共振能量转移机理基于NV色心特殊的能级结构[15]，如图3所示，当基态3A2的NV色心受637 nm（1.945 eV）的激发光照射后，会吸收能量跃迁至激发态3E，激发态是不稳定的，电子会通过自发辐射能量回到基态，释放出荧光，通过637 nm激光的激发，可以实现荧光的“开关”效应。
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图 3 NV色心能级结构示意图[16] Figure 3 Schematic diagram of NV color center energy level structure |
氮−空位色心荧光的“开关”机制，结合激STED、SIM、STORM等亚衍射级荧光显微镜成像技术，能够实现高精度成像。
除了荧光发光现象外，一般情况下，ms=±1的两个能级是简并的，在外加D = 2.8 GHz磁场的作用下，这两个能级会发生劈裂，改变NV色心的量子自旋状态。利用这一性质，结合亚衍射级荧光显微镜成像技术，可以实现多种物理场的高精度测量，其精度参数如表1所示。
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表 1 NV色心探测各物理场的性能[17] Table 1 The performance of NV color center detection for each physics |
一般情况下，选择纳米颗粒状态的色心金刚石做荧光探针，称为荧光纳米金刚石（fluorescent nanodiamonds，FND）。
2 基于荧光探针的成像技术基于荧光探针的成像技术主要可以分为三类，即STED、SIM、单分子定位显微镜（single-molecule localization microscopy，SMLM），其中STED方法可以直接提供亚衍射级分辨率的图像，“所见即所得”，实时成像；而SIM和SMLM则需要通过数学重建算法实现亚衍射级成像，造成成像延迟，并且重建算法的质量会影响图像的质量[6]。
STED方法的原理如图4所示，该图片来自Nicole Gleichmann的工作。其中左边为常规显微镜，只有一束绿色入射光束，分辨率受到阿贝极限限制。右边为STED显微镜，入射光束被分为绿色光束和红色的空心耗尽光束，后者使得边缘的荧光探针被“关闭”，从而突破衍射极限。可以看到，其分辨率将从200 nm提升到50 nm甚至更高[3]。
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图 4 STED原理示意图 Figure 4 Schematic diagram of STED |
空心耗尽光束光强为ISTED，饱和光强为IS，根据公式
| $1$ \mathit{\mathit{\mathit{\mathit{\mathrm{\mathit{d}}}}}}=\frac{\lambda}{2n\sin\alpha+I_{\text{STED}}/I_{\mathrm{S}}} $$ |
可以看到，理论上，空心耗尽光束光强可以无限增大，STED的分辨率可以无限小。但为了规避实际成像中空心耗尽光束对样品的损伤，需要选择合适的光强，一般被限制在5×103 mW/m3以下，因而其分辨率往往被限制在20 nm以上[24-25]。
STED法已被广泛应用于成像，其分辨率可以到达15 nm[26]。通过结合固体浸入透镜（solid immersion lens，SIL）技术，用NV色心提高折射率和荧光亮度，其精度甚至可以达到2.4 nm[27]，如图5所示。
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图 5 STED-SIL原理示意图 Figure 5 Schematic diagram of STED-SIL principle |
在此基础上，根据推广到基态耗尽 （GSD）[28-29]、电荷态耗尽（CSD）方法[30]等，这些新的方法所需的耗尽光束强度远小于STED方法，一般低于50 mW/m3，可以有效规避对样品的光损伤，因此可以进一步提升成像分辨率到10 nm以下[28-29]乃至4.1 nm[30]。
SIM原理如图6所示[31]。在光路上插入光栅、空间光调制器等装置，将入射光调制成光束亮度规律性变化的图案入射到样品上，收集样品反射的荧光信号。通过移动和旋转装置获得不同（至少3种角度）的荧光信号反馈并用计算机对其图像进行数学重建。结构光规避了光束的衍射，从而实现突破衍射极限的目的。这类成像机制不太需要荧光可以“开关”的特性，因此色心在这一领域的应用相对较少。
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图 6 SIM原理示意图 Figure 6 Schematic diagram of SIM principle |
STED和SIM成像都是确定性成像技术，SMLM则是基于随机性的成像方法，包括STORM、光活化定位显微镜、量子成像技术等，以STORM技术为代表。
STORM技术是基于对单个荧光点的精确定位技术[6]。阿贝极限指出，当若干个荧光点同时发光时，光点之间会发生衍射，因此STORM 技术考虑每个循环里只让一部分随机的荧光点发光的方法避免距离较近的不同荧光点之间衍射对分辨率的不利影响，通过多次循环，将得到的图像同样通过计算机数学重建算法进行组合，从而得到亚衍射级分辨率的图像。这种方法理论上可以达到极高的分辨率，但其提高分辨率需要大量的循环次数，对计算量提出极大要求，导致分辨率受到算法和计算机算力的极大限制。但这一方法的优势是需要的入射光强可以低0.1 mW，适用于高质量的样品。且该方法统计的光子计数与电子自旋直接相关，因此可与光探测磁共振（ODMR）技术结合，实现微物理场的检测。Pfender M团队应用STORM技术对NV色心进行成像，其半高全宽（full width at half maximum，FWHM）达到了27 nm，如图7所示[32]。
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图 7 STORM成像 与一维方向点扩散函数[32] Figure 7 STORM imaging and 1D directional point spread function |
Tzeng等[33]用白蛋白包裹荧光纳米金刚石（FND）导入hela细胞内部进行荧光标记，基于FND分别进行共聚焦和STED成像和荧光强度检测，如图8所示。可以看到，STED 的精度达到了40 nm左右，大大超越了共聚焦显微镜的精度，且点扩散函数半高全宽极窄，为活性生命体内生命活动的研究提供了实时且高精度成像的方法。
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（a）共聚焦图像；（b）STED图像；（c）白线方向的荧光强度 图 8 共聚焦和STED对FND标记的细胞进行成像[33] Figure 8 Confocal and STED imaging of FND-labeled cells |
在以上实验的基础上，Gregoire Laporte和Demetri Psaltis实现了基于绿色FND（gND）的STED成像[34]，如图9所示。绿色FND可以有效地与常见的红色有机染料区分开来，实现双色STED成像，同时表征多种特异性结构。
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图 9 共聚焦和STED对gND标记的细胞进行成像[34] Figure 9 Confocal and STED images of gND-labeled cells |
Prabhakar团队则用STED-TEM光电联合显微镜（CLEM）对内体囊泡中内化了FND的MDA-MB-23 细胞进行成像，如图10所示[35]。可以看到，FND可以在恶劣的电镜样品制备条件下存在，并且可以直接在TEM超薄切片上使用STED和其他荧光显微镜成像。STED图像可以作为TEM图像的补充，弥补电镜图像无法感知荧光定位信号的缺陷。
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（a）SLEM成像图，灰色为TEM图，洋红色为STED收集的FND荧光信号；（b）（c）线框区放大后的TEM、STED图；（d）蓝框处荧光强度分布及其洛伦兹拟合 图 10 SLEM显微镜对FND标记的细胞进行成像[35] Figure 10 Imaging of FND-labeled cells by SLEM microscopy |
FND在CLEM成像领域有着光明的应用前景，因为金刚石机械性能优异且能在高能电子束下保持稳定；由于原子密度大，它们还可以在电子显微镜中提供有用的对比度[36]。
基于NV色心的亚衍射级成像技术可以还用于微纳结构半导体发射器，对交替GaP/GaInP段（“条形码”）形成的异质结构半导体纳米线，利用GaInP片段特有的光致发光效应，运用GSD技术对其进行成像，其精度为78 nm左右。结合反卷积算法，可以提高到75 nm[37]。由于FND的荧光稳定性，在SMLM技术中，他们不仅可以作为荧光标记，还可以用作基准标记，用于校正由于环境振动、电噪声等外界原因导致载物台物理位移而引起的图像像差。A. Balinovic团队的工作展示了这一点，如图11所示[38]。可以看到，如果没有FND 作为基准标记，在较长的图像采集时间（
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(a)(b)校准前和校准后FND的SMLM图像；(c)(d)校准前和校准后FND和其他染料染色后的细胞的SMLM图像[38] 图 11 用FND作为基准标记进行成像 Figure 11 Imaging using FND as a benchmark marker |
金刚石氮−空位色心因其优异的性能，如稳定的发光特性，独特的光学亮态、暗态转换特性，较长的电子自旋相关时间，极高的生物兼容性等，作为新型量子探针在亚衍射级成像领域扮演着重要角色。金刚石NV色心还可以利用其自旋特性在微观物理场检测领域发挥关键作用。
本文详细分析了NV色心的荧光机理，介绍并对比了三类常见的亚衍射级成像技术，发现三类方式各有优势和不足：其中，STED成像实时直观，但缺点是需要“逐点扫描”，成像缓慢，受光强限制，分辨率有限，需要与其他技术结合或者进一步改进；SIM成像速度更快，但需要图像重建，容易引入误差，需要寻找更好的图像重建算法[36]；STORM同样存在类似问题，不过其需要的光强极低，适用于高质量样品。总之各种成像方式有其优势和劣势，需要根据应用场景选择合适的方法。此外，相关技术的优化也是未来重要的研究方向。
为拓展NV色心在成像领域的应用，需要考虑如何抑制纳米金刚石的“团聚效应”，FND的团聚会使细胞标记变得困难，生成更厚的结构，使得STED显微镜解析更困难，同时颗粒大小和色心密度的不均匀性会使定量研究复杂化[34]。一些研究指出，纳米金刚石锥阵列可以固定纳米金刚石位置，避免团聚效应，并且具有其他优势，如可以主动刺穿样品实现成像[39]，无需吞入样品或其他导入过程；纳米结构还可以作光学腔，实现高效的光捕获和提取[40]。通过这种结构，NV色心可以更好地满足相关领域的成像需求。
此外，还需要进一步研究光场调控技术，优化光路，通过性能更佳的光学系统降低需要的入射激光功率，提高成像效率，使基于NV色心的亚衍射级成像技术能更好的应用于生物、材料科学、机电微纳系统等相关领域。
| [1] | ENDERLEIN J. Advanced fluorescence microscopy[J]. Comprehensive Biomedical Physics, 2014, 4: 111–151. |
| [2] | VICIDOMINI G, BIANCHINI P, DIASPRO A. STED super-resolved microscopy[J]. Nature Methods, 2018, 15(3): 173–182. DOI:10.1038/nmeth.4593 |
| [3] | WARD E N, PAL R. Image scanning microscopy: an overview[J]. Journal of Microscopy, 2017, 266(2): 221–228. DOI:10.1111/jmi.12534 |
| [4] | DOKSANI Y, WU J Y, DE LANGE T, et al. Super-resolution fluorescence imaging of telomeres reveals TRF2-dependent T-loop formation[J]. Cell, 2013, 155(2): 345–356. DOI:10.1016/j.cell.2013.09.048 |
| [5] | CHEN X, WANG Y, ZHANG X W, et al. Advances in super-resolution fluorescence microscopy for the study of nano-cell interactions[J]. Biomaterials Science, 2021, 9(16): 5484–5496. DOI:10.1039/D1BM00676B |
| [6] | MÖCKL L, LAMB D C, BRÄUCHLE C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel prize in chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2014, 53(51): 13972–13977. DOI:10.1002/anie.201410265 |
| [7] | 王晓驰, 常刚, 曹瑞军, 等. 近红外荧光染料的结构、性质及生物荧光成像应用[J]. 化学进展, 2015(7): 794–805. |
| [8] | TIAN F X, XU G L, ZHOU S, et al. Principles and applications of green fluorescent protein-based biosensors: a mini-review[J]. Analyst, 2023, 148(13): 2882–2891. DOI:10.1039/D3AN00320E |
| [9] | SU L J, FANG C Y, CHANG Y T, et al. Creation of high density ensembles of nitrogen-vacancy centers in nitrogen-rich type Ib nanodiamonds[J]. Nanotechnology, 2013, 24(31): 315702. DOI:10.1088/0957-4484/24/31/315702 |
| [10] | YAMAMOTO T, MÜLLER C, MCGUINNESS L P, et al. Strongly coupled diamond spin qubits by molecular nitrogen implantation[J]. Physical Review B, 2013, 88(20): 201201. DOI:10.1103/PhysRevB.88.201201 |
| [11] | 于会尧. 金刚石氮—空位色心系综传感器的性质、制备及应用研究[D]. 合肥: 中国科学技术大学, 2021. |
| [12] | ZHANG J X, XU L X, BIAN G D, et al. Diamond nitrogen-vacancy center magnetometry: advances and challenges[J]. arXiv: 2010.10231, 2020. |
| [13] | WANG Y S, YU H L, ZHANG Y, et al. Development and application of several fluorescent probes in near infrared region[J]. Dyes and Pigments, 2021, 190: 109284. DOI:10.1016/j.dyepig.2021.109284 |
| [14] | ZHANG Q, GUO Y H, JI W T, et al. High-fidelity single-shot readout of single electron spin in diamond with spin-to-charge conversion[J]. Nature Communications, 2021, 12(1): 1529. DOI:10.1038/s41467-021-21781-5 |
| [15] | ZHANG Q, YIN J, YAN Y H, et al. Biocompatible nanotomography of tightly focused light[J]. Nano Letters, 2022, 22(5): 1851–1857. DOI:10.1021/acs.nanolett.1c03905 |
| [16] | 翟陈婷, 唐军, 郭浩, 等. 等离子体增强纳米金刚石荧光特性[J]. 科学技术与工程, 2016, 16(10): 76–79. DOI:10.3969/j.issn.1671-1815.2016.10.014 |
| [17] | 董杨, 杜博, 张少春, 等. 基于金刚石体系中氮-空位色心的固态量子传感[J]. 物理学报, 2018, 67(16): 160301. |
| [18] | TAYLOR J M, CAPPELLARO P, CHILDRESS L, et al. High-sensitivity diamond magnetometer with nanoscale resolution[J]. Nature Physics, 2008, 4(10): 810–816. DOI:10.1038/nphys1075 |
| [19] | BALASUBRAMANIAN G, CHAN I Y, KOLESOV R, et al. Nanoscale imaging magnetometry with diamond spins under ambient conditions[J]. Nature, 2008, 455(7213): 648–651. DOI:10.1038/nature07278 |
| [20] | DOLDE F, FEDDER H, DOHERTY M W, et al. Electric-field sensing using single diamond spins[J]. Nature Physics, 2011, 7(6): 459–463. DOI:10.1038/nphys1969 |
| [21] | TOYLI D M, DE LAS CASAS C F, CHRISTLE D J, et al. Fluorescence thermometry enhanced by the quantum coherence of single spins in diamond[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(21): 8417–8421. |
| [22] | KUCSKO G, MAURER P C, YAO N Y, et al. Nanometre-scale thermometry in a living cell[J]. Nature, 2013, 500(7460): 54–58. DOI:10.1038/nature12373 |
| [23] | DOHERTY M W, STRUZHKIN V V, SIMPSON D A, et al. Electronic properties and metrology applications of the diamond NV− center under pressure[J]. Physical Review Letters, 2013, 112(4): 047601. |
| [24] | BLOM H, WIDENGREN J. Stimulated emission depletion microscopy[J]. Chemical Reviews, 2017, 117(11): 7377–7427. DOI:10.1021/acs.chemrev.6b00653 |
| [25] | MÜLLER T, SCHUMANN C, KRAEGELOH A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale[J]. ChemPhysChem, 2012, 13(8): 1986–2000. DOI:10.1002/cphc.201100986 |
| [26] | ARROYO-CAMEJO S, ADAM M P, BESBES M, et al. Stimulated emission depletion microscopy resolves individual nitrogen vacancy centers in diamond nanocrystals[J]. ACS Nano, 2013, 7(12): 10912–10919. DOI:10.1021/nn404421b |
| [27] | WILDANGER D, PATTON B R, SCHILL H, et al. Solid immersion facilitates fluorescence microscopy with nanometer resolution and sub-ångström emitter localization[J]. Advanced Materials, 2012, 24(44): OP309–OP313. |
| [28] | HAN K Y, KIM S K, EGGELING C, et al. Metastable dark states enable ground state depletion microscopy of nitrogen vacancy centers in diamond with diffraction-unlimited resolution[J]. Nano Letters, 2010, 10(8): 3199–3203. DOI:10.1021/nl102156m |
| [29] | RITTWEGER E, WILDANGER D, HELL S W. Far-field fluorescence nanoscopy of diamond color centers by ground state depletion[J]. Europhysics Letters, 2009, 86(1): 14001. DOI:10.1209/0295-5075/86/14001 |
| [30] | CHEN X D, ZOU C L, GONG Z J, et al. Subdiffraction optical manipulation of the charge state of nitrogen vacancy center in diamond[J]. Light: Science & Applications, 2015, 4(1): e230. |
| [31] | ZHOU B, WANG K H, CHEN L Y. Recent progress on the reconstruction algorithms of structured illumination microscopy[J]. Chinese Optics, 2022, 15(6): 1211–1227. DOI:10.37188/CO.EN.2022-0011 |
| [32] | PFENDER M, ASLAM N, WALDHERR G, et al. Single-spin stochastic optical reconstruction microscopy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(41): 14669–14674. |
| [33] | TZENG Y K, FAKLARIS O, CHANG B M, et al. Superresolution imaging of albumin-conjugated fluorescent nanodiamonds in cells by stimulated emission depletion[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50(10): 2262–2265. DOI:10.1002/anie.201007215 |
| [34] | LAPORTE G, PSALTIS D. STED imaging of green fluorescent nanodiamonds containing nitrogen-vacancy-nitrogen centers[J]. Biomedical Optics Express, 2016, 7(1): 34–44. DOI:10.1364/BOE.7.000034 |
| [35] | PRABHAKAR N, PEURLA M, KOHO S, et al. STED-TEM correlative microscopy leveraging nanodiamonds as intracellular dual-contrast markers[J]. Small, 2018, 14(5): 1701807. DOI:10.1002/smll.201701807 |
| [36] | TORELLI M D, NUNN N A, SHENDEROVA O A. A perspective on fluorescent nanodiamond bioimaging[J]. Small, 2019, 15(48): 1902151. DOI:10.1002/smll.201902151 |
| [37] | ORACZ J, ADOLFSSON K, WESTPHAL V, et al. Ground state depletion nanoscopy resolves semiconductor nanowire barcode segments at room temperature[J]. Nano Letters, 2017, 17(4): 2652–2659. DOI:10.1021/acs.nanolett.7b00468 |
| [38] | YI J, MANNA A, BARR V A, et al. Highly multiplexed, super-resolution imaging of T cells using madSTORM[J]. Journal of Visualized Experiments, 2017(124): 55997. |
| [39] | WANG Y, YANG Y, YAN L, et al. Poking cells for efficient vector-free intracellular delivery[J]. Nature Communications, 2014, 5(1): 4466. DOI:10.1038/ncomms5466 |
| [40] | HAUSMANN B J M, KHAN M, ZHANG Y N, et al. Fabrication of diamond nanowires for quantum information processing applications[J]. Diamond and Related Materials, 2010, 19(5/6): 621–629. |