引　言

氨基酸是构成蛋白质的基本单元，在人体生命活动中发挥重要作用，因此对必需氨基酸需保证日常摄入。但该类物质在生物体内含量较少且成分复杂，其含量测定面临显著挑战^[1]。目前，氨基酸成分的分离检测方法包括氨基酸自动分析仪法、色谱法^[2]、分光光度法^[3]及近红外光谱法^[4]。这些方法耗时长且需要专业人员操作，难以推广应用。因此，迫切需要开发高效的氨基酸检测方法。

表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scatting，SERS）是一种通过分子振动来获取分子特征图谱的高灵敏度分子检测技术^[5]。它可以实现对分子的快速无损检测^[6]，已被广泛应用于生物医学、食品安全和化学分析等领域^[7]。高灵敏度、高增强因子基底可显著提升SERS检测性能。随着SERS技术的持续发展，新型基底材料及制备方法不断涌现^[8]。周俊杰等^[9]利用磁控溅射结合脱合金技术制备出的岛状纳米多孔金基底对罗丹明进行检测，结果显示SERS光谱强度和检测物质浓度的动态响应范围可达3个数量级。黄梦萍等^[10]采用ZIF-8@Au复合基底对多种氨基酸进行筛选性检测，实验结果显示该基底对缬氨酸、半胱氨酸和色氨酸在10⁻¹～10⁻³ mol/L浓度范围内具有较好的线性响应。但上述文献中所使用的SERS基底合成步骤复杂，且常需使用有毒化学物质，因此需开发更简单环保的增强基底制备方法。Kneipp等^[11]证明，球形纳米颗粒比其他形态的纳米颗粒能产生更强的SERS信号。另外，核壳SERS基底由两种或多种材料组合而成，不仅兼具各组分材料特性，还在界面处产生局部表面等离子体共振（localized surface plasmon resonance，LSPR），从而增强SERS效果^[12]。

鉴于上述分析，本文采用金核银壳纳米粒子（gold core silver shell nanoparticles，Au@Ag NPs）对氨基酸进行SERS检测。该结构兼具金纳米粒子（gold nanoparticles，Au NPs）的化学稳定性和银纳米粒子（silver nanoparticles，Ag NPs）的SERS增强效应。外层的银壳可有效屏蔽金核合成阶段残留的柠檬酸钠对检测的干扰，同时纳米粒子间形成的LSPR热点能显著增强目标分子的SERS信号^[13-14]。

1 实验部分 1.1 实验药品和仪器

硝酸银（AgNO₃，质量分数ω = 99.9 %），氯金酸（HAuCl₄，ω = 99%），罗丹明6G（R6G，ω = 95%），色氨酸（ω = 99%）、甘氨酸（ω = 99.5%）、酪氨酸（ω = 99%）、缬氨酸（ω = 99%）、异亮氨酸（ω = 99%）、亮氨酸（ω = 99%）、精氨酸（ω = 98%）、赖氨酸（ω = 98%）、天门冬氨酸（ω = 99%）、谷氨酸（ω = 99%）、苯丙氨酸（ω = 99%）、丝氨酸（ω = 99%）、组氨酸（ω = 99%）、脯氨酸（ω = 99%）和丙氨酸（ω = 99%）购自上海麦克林，柠檬酸钠（Na₃C₆H₅O₇·2H₂O，ω = 99.99%）购自上海阿拉丁。所用化学试剂均为分析纯。超纯水（电阻率 18.2 MΩ·cm）用纯水机（UPT–I–5，成都优普）制备。所有玻璃器皿在使用前后均用大量去离子水清洗。实验废液均按要求进行了分类收集。

使用紫外–可见分光光度计（UV–2600i，日本岛津）在300～800 $ \mathrm{n}\mathrm{m} $波段测定Au NPs 和Au@Ag NPs的吸收光谱。使用共聚焦拉曼光谱仪（XploRA PLUS，HORIBA Scientific）对目标样本进行SERS测试。使用纳米粒度电位仪（Zetasizer Nano–ZS90，英国马尔文）进行粒度分布的测定。

1.2 Au NPs和Au@Ag NPs的制备

本研究通过柠檬酸钠还原HAuCl₄来制备球形金纳米粒子。在100 $ \mathrm{m}\mathrm{L} $锥形瓶中加入99 $ \mathrm{m}\mathrm{L} $超纯水，280 r/min磁力搅拌加热。至50 ℃时加入1 mL HAuCl₄溶液，持续加热至沸腾后，快速添加2.5 mL新配制的柠檬酸钠（ω = 1%），调节转速至380 r/min。Au³⁺被柠檬酸钠还原，维持沸腾条件至溶液由淡黄色变为酒红色。停止加热后继续搅拌20 min获得金溶胶，室温静置冷却。取适量溶胶离心（9 600 r/min，10 min，离心半径15 cm），除去上清液后得到浓缩Au NPs沉淀。将其保存于棕色玻璃瓶中，4 ℃存放备用。

将金纳米粒子作为种子，采用种子生长法获得金核银壳纳米粒子。将浓缩的Au NPs沉淀磁力搅拌（380 r/min）加热至60 ℃时，加入5 $ \mathrm{m}\mathrm{L} $柠檬酸钠（ω = 1%）。持续加热至沸腾后，迅速加入1.8 $ \mathrm{m}\mathrm{L} $ 0.1 mol/L的AgNO₃溶液，继续搅拌并持续煮沸40 min。之后停止加热，继续搅拌至溶液冷却至室温。柠檬酸钠会将AgNO₃中的Ag⁺还原为单质银。单质银将附着在金种子表面形成银壳。当溶液从酒红色慢慢转变为焦糖色则表明金核银壳纳米粒子已经形成。将金银溶胶离心（9 600 r/min，10 min，离心半径15 cm），除去上清液后得到浓缩 Au@Ag NPs沉淀。将其保存于棕色玻璃瓶中，4 ℃存放备用。图1所示为金核银壳纳米粒子的制备过程。

1.3 SERS检测

制备浓度为0.1 mol/L的丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、酪氨酸、组氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和脯氨酸溶液，以及浓度为1 mmol/L的R6G溶液，待测备用。

取25 μL Au NPs或Au@Ag NPs，分别滴加在载玻片上，再滴加25 μL待测样品。使用共聚焦拉曼光谱仪进行SERS测试，参数设置为：激光功率15 mW，波长638 nm，显微物镜10×，积分时间3 s，曝光次数2次^[15]，狭缝宽度30 μm，分辨率 5 cm⁻¹，光谱采集范围300～1 800 cm⁻¹。

2 结果与讨论 2.1 Au@Ag NPs的表征

使用紫外–可见分光光度计测定Au NPs和Au@Ag NPs的吸收光谱，结果如图2（a）所示。Au NPs在520 nm附近有一个较强的吸收峰，与金的表面等离子体共振相一致 ^[16-17]。Au@Ag NPs的吸收峰位于420 nm附近，该峰归因于银的横向等离子体共振吸收^[18]。这两个吸收峰证明溶胶中存在Au和Ag两种纳米粒子。吸收峰的半峰宽与纳米颗粒粒径分布正相关，峰宽越窄表明颗粒尺寸均一性越高。为进一步描述衬底颗粒的大小，采用纳米粒度电位仪测定两种粒子的粒径分布，结果如图2（b）所示：Au NPs和Au@Ag NPs的平均粒径分别为17 和48 nm左右，且均匀性较好。纳米颗粒的粒径会影响SERS基底增强效果。通常，粒径减小会导致比表面积增大，引发LSPR峰蓝移（峰值波长减小）；而粒径增大则会减小比表面积，导致LSPR峰红移（峰值波长增大）^[9]。基底上相邻Au@Ag NPs间的间隙越小，形成的LSPR热点密度越高^[19]。

一般情况下，将拉曼探针分子作为待测物质，对所制备的金属纳米粒子的SERS基底增强效果进行校验。R6G因其优异的拉曼特性，以及在金属纳米粒子表面选择性的吸附能力，被广泛用作拉曼探针分子 ^[20]。采用1 mmol/L R6G溶液作为标准样品进行SERS检测，通过对比其在不同基底（Au NPs与Au@Ag NPs）上的信号强度，评估两种纳米材料的增强效应。如图3（a）和（b）所示，在1 520 cm⁻¹处，Au@Ag NPs的SERS信号强度约为Au NPs的2倍，结合20个随机点测量的Au@Ag NPs的峰强度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.8 %，表明Au@Ag NPs基底增强效果及稳定性均优于Au NPs。接着，绘制了8 μm×8 μm区域的SERS映射图，并分析了对应的光谱数据。如图3（c）所示，R6G在1 520 cm⁻¹处的映射图颜色分布均匀，表明Au@Ag NPs的增强效果具有高度的一致性和良好的可重复性。对Au@Ag NPs表面64个随机位点进行SERS重复检测，所得光谱图高度重叠，表明其具有稳定的增强性能，详见图3（d）。

2.2 氨基酸的SERS特性

因Au@Ag NPs具有更好的增强性和稳定性，选其作为基底，对氨基酸进行检测。结果显示，Au@Ag NPs对苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、异亮氨酸和甘氨酸的响应较好，具体的拉曼光谱见图4，各拉曼特征峰位置及其归属见表1。实验所测得的各氨基酸主要拉曼峰位置与文献[21-30]所报道的基本一致。

图5所示为不同浓度的苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、异亮氨酸和甘氨酸的SERS光谱图。可以看到，随着氨基酸浓度的降低，SERS信号强度也随之变弱。当浓度为0.1、0.01和0.001 mol/L时，分别选取1 001、1397和1638 $ {\mathrm{c}\mathrm{m}}^{-1} $处的峰作为苯丙氨酸、丙氨酸和精氨酸的浓度特征峰，其信号强度与浓度呈线性关系，相关系数分别为$ \mathop R\nolimits_{苯丙}^2 $= 0.9826，$ \mathop R\nolimits_丙^2 $= 0.9483，$ \mathop R\nolimits_精^2 $= 0.9901，详见图5（a）～（f）。Au@Ag NPs对酪氨酸和组氨酸的检测更为灵敏，检测限可达1×10⁻⁴ $ \mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}/\mathrm{L} $。分别选取1 585和1 574 $ {\mathrm{c}\mathrm{m}}^{-1} $处的峰作为酪氨酸和组氨酸的浓度特征峰，其信号强度和浓度呈线性关系，相关系数分别为$ \mathop R\nolimits_酪^2 $=0.990 7，$ \mathop R\nolimits_组^2 $=0.9900，详见图5（g）～（j）。但对于异亮氨酸和甘氨酸，Au@Ag NPs对其检测限仅为1×10⁻² $ \mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}/\mathrm{L} $，灵敏度不高，见图5（k）～（l）。从图5可知，基于Au@Ag NPs基底，这7种氨基酸在0.01 $ \mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}/\mathrm{L} $浓度时的SERS信号强度远低于0.1 $ \mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}/\mathrm{L} $浓度时的信号强度。这表明，在氨基酸的SERS检测中，目标物浓度是影响检测限和检测精度的重要因素，也提示增加氨基酸富集度是提高检测精度的有效途径。

3 总　结

与单一Au NPs基底相比，Au@Ag NPs基底的核壳结构通过调谐LSPR特性显著增强SERS效应。小粒径Au@Ag NPs因表面能较高更易聚集，在电磁耦合作用下，相邻粒子间形成高密度热点，进一步放大拉曼信号。利用Au@Ag NPs基底，实现了对苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸等7种氨基酸的SERS检测。当浓度为1×10⁻¹～1×10⁻³ $ \mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}/\mathrm{L} $时，以上氨基酸的浓度与SERS信号强度呈线性相关，且相关系数均大于0.94。与其他SERS基底制备方法相比，本文的制备方法具有环境友好、操作简便等优势，适用性更广。基于该方法制备的Au@Ag NPs基底对苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、异亮氨酸和甘氨酸均表现出显著的SERS增强效应，并支持单基底多目标检测，从而能节约制备时间并简化流程，为后续利用同一基底进行多分子定量检测提供高效参考方案。