引　言

在世界范围内，癌症患者的发病和死亡数量持续增长。根据中国国家癌症中心与美国癌症协会的数据统计：2022 年，中国和美国分别有大约 482 万和 192 万的新发癌症病例，以及 321 万和 61 万的癌症死亡病例^[1-2]。肿瘤学中最具挑战性的问题之一就是抗癌药物的开发与药效评估速度。与其他适应症药物相比，肿瘤药物从临床前研发到 Ι 期临床试验获得批准的成功率低至7%。考虑到肿瘤药物临床开发的高成本和长耗时，迫切需要更好的临床前药物筛选平台^[3]。

在培养肿瘤细胞时，通常采用的是二维培养技术。但越来越多的研究表明，相比于真实人体环境，二维培养单层肿瘤细胞的过程中既缺失了许多组织特异性结构，也缺少细胞与细胞、细胞与基质间的相互作用^[4]。而采用三维培养获得的肿瘤细胞球、类器官、器官芯片等则保留了许多重要的生物学功能^[5-6]。有些功能在二维培养的单层细胞中会遭到破坏。这使得人们对三维培养技术愈发感兴趣。

多细胞球培养方法最早由Sutherland及其同事于1970年提出，用于研究肿瘤细胞的功能表型及其疗效观察。自此，球体培养作为一种新的培养方式，应用于多种细胞的培养。在培养过程中，从肿瘤细胞球体表面到内部致密细胞结构之间可以形成氧气、营养物质、代谢物及药物等的含量梯度差。这对研究人体中肿瘤细胞的耐药性具有重大意义^[7-8]。Karlsson等^[9]提出，相比于孔板培养的单层细胞，三维肿瘤细胞球因为药物扩散障碍、增殖缓慢、具有干细胞特征等原因，对同一种化疗药物会表现出更强的耐药性，更加接近临床模型。然而，在肿瘤细胞球的培养过程中，如何促进细胞聚团，以及保证球体大小均匀是一项高难度的挑战。常规肿瘤细胞球的培养方法有4种：使用低吸附培养板培养、悬滴培养、动态灌注培养和基于微流控技术的细胞3D打印。

随着超精密加工技术的进步，微腔结构对细胞生长聚团的影响效果得到重视，越来越多的研究者开始使用微孔阵列进行三维细胞形态的培养。2017年，Gumuscu等^[10]制作了约含500个水凝胶隔间的微流控三维培养平台，用于人肠道细胞与肠道细菌相互作用的高通量研究。Baptista等^[11]利用聚合物薄膜微腔阵列进行了人类支气管类器官的培养。他们先在基质胶液滴中进行了器官预培养，然后将预培养的器官转入到微腔阵列芯片中。结果显示，类器官在微腔中可继续生长7周，从而验证了类器官能够在微腔环境中长时间培养。Brandenberg等^[12]在聚合物–水凝胶底物的微腔阵列中培养了数千个胃肠道细胞球，并进行了实时分析。

本研究基于微流控芯片加工技术，设计了一种微腔阵列芯片。采用该芯片，构建了同步完成肿瘤细胞球快速三维培养与高效药物筛选的全流程解决方案。讨论了常见化疗药物，吉西他滨（Gemcitabine）与伊立替康（Irinotecan）对小鼠乳腺癌细胞系（4T1）肿瘤细胞球的抑制作用。结果显示，细胞死亡率与所用药物浓度成正比。相比于传统孔板，采用微流控芯片可缩短实验时间、减少试剂消耗、简化操作流程。本研究为三维细胞球的快速培养及药物筛选提供了新的技术方案。

1 实验部分 1.1 试剂和仪器

实验所用试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（phos-phate buffer solution，PBS）、RPMI 1640 培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素/链霉素溶液（100×）购于赛默飞公司，Calcein-AM/PI 双染试剂盒购于东仁化学科技（上海）有限公司，光刻胶SU–8 2150购于MicroChem公司，Counting Kit–8（CCK–8）细胞增殖试剂盒购于UElandy公司，伊立替康（CPT–11）、吉西他滨（LY–188011）均购于美国Selleck公司。

主要仪器：紫外曝光机（SUSS MicroTec MJB4，德国）、台式匀胶机（SC–1B，中国）、激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss LSM 900，德国）、酶标仪（TECAN M Nano，瑞士）。

1.2 微流控芯片的制备

采用autoCAD软件进行微流控芯片的设计，使用软光刻方法制作两层结构的微流控芯片。用第一层光刻基座制作围栏，见图1（a）；用第二层光刻微柱阵列模型制作微腔阵列，见图1（b）。在直径为100 mm的硅片抛光面上依次进行匀胶和光刻。首先，通过第一层掩膜版[见图1（c）]对光刻胶进行曝光，显影后形成基座结构；然后，利用套刻对准系统将第二层掩膜版[见图1（d）]的微腔结构与基座精确对准，进行二次光刻。

完成阳模制备后，将聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）预聚体与固化剂按10∶1质量比混合，并充分搅拌，经真空脱气后浇注至经三甲基氯硅烷疏水化处理后的模具表面，经80℃加热固化2 h后剥离。将剥离得到的PDMS层浸泡在异丙醇中，洗去表面残留的三甲基氯硅烷，再用去离子水清洗3遍，得到PDMS微流控芯片结构。

1.3 细胞培养

小鼠乳腺癌细胞系（4T1）购自美国细胞培养协会细胞库，用RPMI 1640培养基（按体积分数添加10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素）在细胞培养瓶（Corning，430641）中进行培养，每隔1 d更换1次培养基，每隔3 d传代1次，传代比例为1∶4。细胞培养环境为：温度37 ℃、湿度95%、CO₂体积分数5%。

1.4 芯片中细胞接种

接种细胞前，需将制作完成的PDMS微流控芯片用锡纸包裹，放入压力锅进行高温灭菌（0.1 MPa，120 ℃，20 min）。传代时，用移液器在芯片的每个大腔室中注入4 μL消化好的细胞悬液（约含5 000个细胞）。将芯片置于培养皿中，在细胞培养箱中静置30～45 min，待细胞自然沉降后，向芯片中加入培养基，至没过整块芯片。再将芯片置于培养箱（温度37 °C，湿度95%，CO₂体积分数5%）中培养。每隔1 d，将芯片内旧的培养基沿微腔边缘抽出，再注入新鲜培养基进行换液。

1.5 细胞荧光染色

肿瘤细胞球在芯片上生长完成后，‌使用Calcein-AM/PI双染试剂盒进行细胞染色‌，染色时间为30 min。‌Calcein-AM可进入活细胞，在细胞内酯酶作用下水解产生绿色荧光‌；‌PI则不能进入细胞膜完整的活细胞，但可进入膜破损的死细胞并与核酸结合产生红色荧光‌。通过检测绿色荧光（活细胞）和红色荧光（死细胞）的分布与强度，可区分细胞存活状态及评估化合物或环境的毒性效应。

1.6 细胞活性实验

药物处理后细胞的活性检测采用CCK–8细胞增殖试剂盒，并利用酶标仪进行阵列扫描，获得检测结果。

2 结果与讨论 2.1 微流控芯片的设计

为了实现高通量的肿瘤细胞球培养，芯片设计为由多组规则间隔的微腔组成，其核心设计思路包括：1）培养初期，单个微腔可促进肿瘤细胞快速聚集，这是形成均匀肿瘤细胞球的关键；2）微腔为细胞提供稳定且独立的生长环境，促使细胞排列为规则阵列；3）通过调控微腔几何结构及微环境，可实现对细胞球的多样化操作。

最终确定，芯片采用直径为500 μm的微腔阵列结构，并采用软光刻的方法进行塑模，见图2（a）。制作完成后的微流控芯片外观呈正方形，见图2（b）。单个微腔直径为500 μm，每2个微腔间隔为50 μm，9个微腔组成一个大的腔室，即构成一个单阵列，如图2（c）所示。单个阵列为边长2 mm的正方形，每2个阵列之间间隔1 mm，整个芯片由6×6个单阵列组成，如图2（d）所示。每个单阵列包含3×3个微腔阵列，整个芯片总计324个微腔，最多可同时对6种不同药物进行检测，每种药物可设置6个浓度梯度。整块芯片可放在细胞培养皿中进行培养。

2.2 芯片中细胞球的培养

实验选用源于BALB/c小鼠常见的小鼠乳腺癌细胞系4T1，它被广泛用于研究人类乳腺癌的体外肿瘤模型中。将正常传代生长的4T1细胞消化后，取部分细胞悬液进行芯片接种。经预实验确定，单个微腔接种细胞数约为500个。微腔的限域效应可促进细胞快速聚团。接种完成后，通过显微镜持续拍摄以记录细胞球形成过程，结果如图3所示。可以看到：接种1 h后，细胞完全沉入微腔中；6 h 后，细胞开始慢慢聚团生长；15 h后，细胞开始明显聚团，并形成细胞球体；48 h后，细胞形成致密肿瘤细胞球，可用于药物筛选实验。

传统三维细胞培养通常采用包被过的普通细胞培养板或超低吸附圆底培养板，细胞接种后48 h才出现聚团效应，至第4 d才形成成熟的肿瘤细胞球^[6]。而采用微流控芯片可将肿瘤细胞球形成周期缩短至15 h，有助于显著提升高通量药物筛选效率。

为检测微腔培养48 h后细胞的活性，使用Calcein-AM/PI在微腔内对细胞进行染色，染色后的共聚焦荧光显微镜成像结果见图4。可以看到，微腔内肿瘤细胞球直径约为200 μm。其中图4（a）为PI染色结果，显示有少量细胞核呈红色荧光；图4（b）为Calcein-AM染色结果，显示细胞球形态完整，仅外围存在未聚团的零散细胞；图4（c）为双染色叠加图像，微腔内细胞大部分呈绿色荧光，极少量细胞核呈红色荧光，表明肿瘤细胞球中细胞状态良好。

为观察微腔培养的细胞球体的立体结构，使用激光共聚焦显微镜对单个微腔中的肿瘤细胞球进行z轴扫描三维重构，扫描间隔1 μm，总计扫描120层，重构得到的三维模型结构如图5所示。可观察到，肿瘤细胞球整体结构完好，细胞存活率大于95%。

2.3 芯片中药物筛选

针对小鼠乳腺癌肿瘤细胞球，选用吉西他滨和伊立替康这2种临床常见的化疗药物进行筛选测试。根据初筛结果，并参考药物临床使用情况^[13]，将复筛浓度梯度确定为：10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L。

为验证微流控芯片中药物筛选结果的可靠性，同时使用96孔板进行4T1细胞的培养及药物筛选实验。每个实验组的样本量为3个，则1张微流控芯片可同时进行2种药物5种不同浓度的筛选。

由于所采用的细胞系不同，测试中细胞的死亡情况与文献报道的结果存在差异。药物作用48 h后，使用CCK–8试剂盒进行细胞活性检测，结果如图6所示。可以发现，吉西他滨与伊立替康对细胞的杀伤效果存在浓度依赖性，且4T1细胞对吉西他滨相对敏感，在低浓度组即出现细胞死亡，而伊立替康只在高浓度时表现出明显的细胞抑制作用。化疗药物对肿瘤细胞的抑制作用存在选择性，这与Lopez等^[14]的报道结果一致。由于肿瘤细胞球具有致密性，药物对其杀伤效果较在96孔板中培养的二维细胞更弱，即肿瘤细胞球存活率更高。该现象符合文献研究结果^[9]，同时也证实了三维细胞球模型能更好地模拟肿瘤在体内的真实状况。

3 结　论

本文通过软光刻的方法，制作了一种可用于肿瘤细胞高效药物筛选的微流控芯片，通过微腔阵列的微孔结构，促进肿瘤细胞的快速聚团生长。传统的二维永生化或原代单层细胞系不能反映体内组织的异质性结构，而芯片培养的方法可以克服这些限制，形成更接近人体环境的肿瘤细胞球体结构。原有三维细胞培养耗时较长，从细胞接种到形成致密细胞球通常需要4 d。且基于96孔板或384孔板的药物筛选涉及繁琐的细胞接种与加药操作，且在大规模药物筛选测试时，消耗的试剂与细胞量较多。本文设计的微流控芯片制作成本低，细胞用量少，能同时进行多种药物的筛选。且每个单阵列中的9个微腔可同时进行细胞接种与加药，单个阵列中不同微腔间的环境高度相似。微腔结构的设计有利于肿瘤细胞快速形成致密性的三维细胞球结构。单次实验中，1张芯片可设计用于6种药物6个浓度梯度的筛选。本文选取了2种临床常见的化疗药物进行药物筛选测试，效果良好，证实了该芯片可用于药物筛选。

与现有技术相比，本文设计存在几个关键优势：快速形成的肿瘤细胞球更适合用于药物筛选；减少了培养试剂与药物试剂的消耗；在进行大规模药筛时，极大程度地减少了细胞培养与药物筛选所需的时间。后续可进一步探究不同的微腔环境，以更好地模拟人体内结构和环境。微腔阵列芯片为快速细胞培养和药物筛选提供了一个重要的平台，在肿瘤细胞药物筛选方面具有广阔的应用前景。