引　言

荧光检测技术是20世纪七八十年代逐渐成熟起来的一种新型检测技术^[1-2]，其优势在于灵敏度高，抗干扰能力强。随着该技术的不断完善，它被广泛应用于生物医学、食品安全、水质检测、药物学以及材料学等领域中^[3-10]。典型的荧光检测分析仪器包括荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、荧光显微镜、基因测序仪、流式细胞仪等。

在众多荧光检测分析仪器内部，往往需要使用一组或多组光学滤光片（以下简称“滤光片”），用于提取荧光信号和滤除光路系统中的干扰光。滤光片性能的高低直接决定着仪器的检测精度和可靠性，是仪器中的核心光学元件。随着检测分析仪器逐渐向着检测速度更快，检测精度更高，检测性能更稳定，结构更加精巧的方向发展，人们对滤光片的性能要求还在不断提升。本文将从滤光片的工作原理、设计理念、设计技术、制备技术以及发展新趋势等方面，分析论述荧光检测分析仪器中的滤光片。

1 滤光片的工作原理

荧光检测分析仪器是基于荧光发光原理设计的。所谓“荧光”，是物质的电子吸收激发光能量跃迁至激发态，在其返回基态过程中发射出的光。荧光物质发射的荧光波长通常大于其激发光谱的波长（如图1所示），其波长差值称为“斯托克斯位移”^[11]。根据这种“斯托克斯位移”现象，再利用光学滤光片的滤光、分光等光谱特性，能够将激发光与荧光分离出来，进而对获得的荧光信号进行后续处理。

对应1种荧光试剂，通常以“激发滤光片”、“发射滤光片”和“分色镜”的组合来完成仪器所需的光学功能，它们称为1个“滤光片组”。其在仪器内部的典型工作过程如图2所示：光源发出的宽谱段混合光，通过“激发滤光片”后形成准单色激发光；该激发光被“分色镜”反射后入射到样本上，激发样本中的荧光试剂发出荧光；荧光经“分色镜”透射后到达“发射滤光片”，同时到达的还有少量激发光和环境杂散光等；“发射滤光片”滤除各种干扰光因素，使最终所需的荧光信号进入光电接收系统。

2 滤光片的设计理念 2.1 与荧光试剂匹配

应用于荧光检测分析仪器中的滤光片，在设计时必须考虑其光谱特性与所使用荧光试剂的对应关系。

激发滤光片的作用是选择透射特定波段的激发光。在荧光试剂的激发光谱中，谱线所涵盖的光谱波段都能够激发出荧光，并且越靠近谱线峰值的光，其荧光激发效率越高，因此激发滤光片在设计时应尽量包含激发光谱峰值附近的波段。考虑到激发滤光片与发射滤光片的光谱不能重叠，激发滤光片的光谱类型可以分为如图3所示的“短波通型”和“带通型”。

发射滤光片的作用是选择透射特定波段的荧光发射光。在荧光试剂的发射光谱中，谱线所涵盖的光谱波段都是可用的荧光波段，并且越靠近谱线峰值的光，受激发射的荧光能量越强，因此发射滤光片在设计时应尽量包含荧光发射光谱峰值附近的波段。考虑到发射滤光片与激发滤光片的光谱不能重叠，发射滤光片的光谱类型可以分为如图4所示的“长波通型”和“带通型”。

很多荧光检测分析仪器不限于一个检测通道，以荧光PCR仪为例，4～6个检测通道已成为该类仪器的主流。在多通道荧光检测分析仪器中，被测样本中同时包含多种荧光试剂（每个检测通道对应一种荧光试剂），为降低通道之间的信号干扰，激发滤光片和发射滤光片均以“带通型”更为常见。

分色镜的作用是利用透射和反射将激发光和荧光的传播方向分离开，通常倾斜45°使用。根据不同的光路系统设计，分色镜的光谱类型可以是反射激发光、透射荧光的“长波通型”，或者透射激发光、反射荧光的“短波通型”（如图5所示），最常见的是“长波通型”。

2.2 荧光与激发光相互隔离

荧光试剂受激发射的荧光非常微弱，其能量仅相当于激发光的10⁻³～10^{−4 [12-14]}。为了有效检测到荧光信号，必须保证荧光与激发光之间相互隔离。因此，激发滤光片与发射滤光片之间要求有足够的截止深度。

描述滤光片截止区域对光的截止程度，经常使用光密度（optical density, OD）参数，其值D是对滤光片的透射率取常用对数值^[15]

$ D\left(\lambda \right)=-\mathrm{lg}[T\left(\lambda \right)] $

(1)

式中，T（λ）表示在λ波长位置时滤光片的透射率。

为了获得基本的荧光信号，激发滤光片与发射滤光片在整个工作波段（通常为200～1 100 nm）的隔离程度应在OD4以上。为了保障检测仪器的测试精度和准确性，大多数荧光检测仪器要求激发滤光片和发射滤光片的这种隔离程度应达到OD5～OD6，特别是要确保激发滤光片在发射滤光片的透射区波段具有OD6以上的截止深度，相应的，发射滤光片在激发滤光片的透射区波段也应具有OD6以上的截止深度（如图6所示）。

3 滤光片的设计和制造 3.1 设计技术

滤光片的光谱特性是基于光学薄膜技术来设计的。所谓光学薄膜技术，是指利用光学干涉原理，优化设计光学薄膜系统，进而实现对光学元件基底表面光谱特性精准调控的技术。如图7所示，光学元件基底表面镀有多层纳米级光学薄膜，每一层薄膜的膜厚均经过精准设计。入射光在每个膜层表面发生多次的反射和透射，这些光彼此之间产生了干涉效应，最终使光学元件实现既定的滤光或分色等光学效果^[16-18]。

在设计荧光检测分析仪器用滤光片时，首先堆叠足够的膜堆，使滤光片截止区域的宽度和深度满足技术指标要求并留有一定的余量，然后综合采用单纯形法、共轭梯度法、针式法等多种优化方法，降低滤光片透射区域的波纹。在优化过程中，滤光片截止区域的宽度和深度都会变差，因此初始膜系在截止宽度和深度方面所留的余量要足够，如有必要，可对某些关键区域的背景（如激发滤光片与发射滤光片彼此相邻的区域）锁定后再进行优化。增加初始膜系的层数，有利于提高滤光片的性能，但制造难度和制造成本也会显著提升，因此优秀的滤光片设计，往往追求降低设计冗余，即采用尽可能少的光学膜层来达到所需的光谱特性要求。

3.2 制造技术

滤光片的制造通常采用物理气相沉积（physical vapor deposition，PVD）方法，即在真空技术条件下，采用物理方法将薄膜材料表面气化为原子或分子，或者部分电离成离子，通过低压气体过程在基底表面沉积为薄膜。制造荧光检测分析仪器用滤光片，行业上普遍采用以下3类镀膜设备，结合各设备的特点加以介绍。

（1）蒸发镀膜设备。其优点是：膜层沉积速率高，单次镀膜产量大，成本低。其主要缺点是：最大镀膜层数较少（100层左右），膜厚控制精度较低（控制误差为0.5%左右）。要实现彼此隔离达到OD6的激发滤光片和发射滤光片，每个滤光片都需要镀制4～5个子片，胶合在一起才能实现。

（2）磁控溅射设备。与蒸发镀膜设备相比，该类设备成膜的膜层均匀性好，膜厚控制精度较高（控制误差为0.2%左右），最大镀膜层数较多（200层左右）。而相对的缺点是：单次镀膜产量较少，镀膜成本较高。采用该设备制造彼此隔离达到OD6的激发滤光片和发射滤光片，可考虑使用在一个基底的两个表面分别镀膜的方案。

（3）离子束溅射设备。该类设备成膜的均匀性更好，膜厚控制精度更高（控制误差为0.1%左右），镀膜层数可超过500层。而相对缺点是：膜层沉积速率低，单次镀膜产量更小，镀膜成本更高。采用该设备制造彼此隔离达到OD6的激发滤光片和发射滤光片，在一个基底上单面镀膜就可实现。

采用磁控溅射设备或离子束溅射设备制造滤光片，由于单次镀膜的层数较多，必须选择表面光洁度高的优质基底，否则可能出现滤光片表面发雾等现象，影响其光学性能；另一方面，必须开发更好的膜层监控工艺方案，充分降低膜厚误差，否则可能出现实际镀制的滤光片光谱与设计光谱相差甚远的现象。总之，以上3类镀膜设备各有特点，在实际应用中应结合滤光片的光谱特性要求，综合考虑制造难度和制造成本，选择适合的镀膜设备和工艺实现方案。

4 滤光片的发展趋势

随着荧光检测分析仪器的不断发展，滤光片正在经历着一些变化。总的来说，滤光片的发展趋势包括以下几个方面。

4.1 单片集成化

传统的滤光片为多片胶合结构，即通过多个子片共同实现一种所需的光谱特性，如图8（a）所示，每个子片均采用蒸发镀膜设备生产。而随着即时检验（point-of-care testing，POCT）等小型化设备的出现和普及，人们对单片集成化镀膜的需求激增，即仅使用1片基底来实现所需的光谱特性，见图8（b）。实现单片集成化镀膜，要求每次镀膜层数更多，膜厚控制更加精准，往往需要使用磁控溅射设备或离子束溅射设备来实现。

对于滤光片的单片集成化镀膜，欧美等国家具有明显的优势，在膜系设计方法、工艺控制手段和镀膜设备性能等方面都代表着国际领先水平^[19-20]，已经形成了成熟的标准产品和相当的产业规模。国内目前在该领域处于快速发展期，近5年来，国内一些优秀的镀膜企业逐步推出了自己的单片集成化镀膜产品，从一定程度上实现了进口替代，但生产这些滤光片的镀膜设备仍以德国和美国的进口设备为主。

4.2 光谱复杂化

为了优化光路，降低成本，满足设备微型化、集成化的应用需求，越来越多的荧光检测分析仪器采用双通带或多通带滤光片，即在1片滤光片中含有两个或多个光谱通带区域。与之相对应，分色镜也不再是简单的“长波通型”或“短波通型”，而是更趋向于一种综合类型。图9给出了一种典型的双通带滤光片组光谱示意图。

多通带激发滤光片和发射滤光片，其设计难点在于同时满足多个通带的位置、带宽以及所需的截止深度要求。多通带分色镜的设计难点在于，光线45°倾斜入射时，在多个透射带和反射带之间实现高陡度消偏振效果。不同厂商对这些滤光片的设计方法不尽相同，相关报道包括“一维晶体缺陷层模型”、“双对称结构”、“循环嵌套模型”等^[21-25]。

目前，国内在双通带滤光片和分色镜的设计和制造方面进步较快，部分国产产品的光学性能与国际先进水平相差无几，然而对于3通带以上的滤光片和分色镜产品，国内还鲜有厂商稳定量产，而美国的Semrock、Chroma等公司，其标准产品中就包含多种5通带滤光片及配套分色镜。因此，国内光学薄膜行业在复杂光谱的设计和制造方面还有很大的进步空间。

4.3 低波前畸变

有些荧光检测分析仪器对成像品质有高质量需求（如基因测序仪），有些荧光检测分析仪器需要对多个激发光源进行精准合束（如流式细胞仪），此时往往要求滤光片能够对波前畸变进行有效抑制。

波前畸变包含“透射波前畸变”和“反射波前畸变”两类，是指入射光经滤光片作用后，其透射光或反射光的波前（波面）相对于理想波前（波面）的改变程度，如图10所示。波前畸变通常用“xλ@检测波长”的形式表示，其中“检测波长”通常取632.8 nm，而“x”为具体的数值，其值越小代表波前畸变程度越低。

影响滤光片波前畸变的主要因素有两个：

（1）基底质量。当基底的材质均匀，表面光洁度高，表面形变量小时，采用该基底制备滤光片才具备拥有低波前畸变的可能，特别是滤光片的“透射波前畸变”特性几乎完全由基底质量决定。我国当前量产化的光学玻璃基底，波前畸变能够达到优于0.25λ@632.8 nm的行业水平，而国际先进水平可以优于0.1λ@632.8 nm。

（2）膜层应力。镀制在基底上的膜层会产生“张应力”或“压应力”效果，进而拉弯基底的表面形状（如图11所示），严重影响滤光片的“反射波前畸变”特性。针对这一现象，光学薄膜制造企业往往通过“优化膜料选择和膜系设计”、“双面应力匹配镀膜”、“镀膜后退火处理”等手段进行改善。通过多手段结合，膜层应力的影响效果会显著降低。

我国当前商业化的低波前畸变滤光片的透射波前畸变可优于0.25λ@632.8 nm，反射波前畸变可达到（0.25～0.50）λ@632.8 nm的水平，满足大多数中高端仪器的应用需求。应用于更高端仪器的滤光片往往要求透射和反射波前畸变优于0.1λ@632.8 nm。目前仅美国等少数国家具有相对成熟的制备工艺，一个滤光片的价格可高达上千美元，仍处于行业垄断状态。

4.4 更深更锐截止

为了进一步提升荧光检测分析仪器的性能，人们期望借助滤光片使仪器的光学系统获得更优异的信噪比，这推动着滤光片的截止背景向着更深更锐的方向发展。

（1）更深截止。提高滤光片的截止深度，能够使荧光与激发光之间实现更有效的隔离，便于更好地提取荧光信号、抑制干扰光，从而使信噪比得到提升。对于某些使用高功率激光器作为激发光源的仪器而言，滤光片OD6的截止深度已经不能完全满足应用需求，往往需要将截止深度提升到OD7或OD8以上。

（2）更锐截止。滤光片的光谱从透射区向截止区变化得更快——即滤光片的截止陡度更高时，在保障荧光和激发光有效隔离的前提下，能够让滤光片的带宽做得更宽，从而获得更高的激发能量和更强的荧光信号，进而获得更好的信噪比。对于某些使用小斯托克斯位移型荧光试剂的仪器而言，提高滤光片的截止陡度是改善系统信噪比非常重要的手段。

提升滤光片截止背景的深度或陡度，除了使产品制造难度增加以外，在产品的性能检测方面也提出了更高要求。目前，我国光学薄膜行业对滤光片截止深度检测的普遍精度在OD6～OD7的水平，对截止陡度的检测分辨率为3～4 nm；而国际先进水平，截止深度可准确测量到OD9以上，截止陡度的检测分辨率可达1 nm以内。因此，我国光学薄膜行业今后在研究提高滤光片设计制造水平的同时，也应同步提升产品检测水平。

5 结 束 语

在滤光片的设计和制造等方面，欧美等发达国家具有先发优势。但令人欣慰的是，随着我国科技水平的不断进步，国产滤光片的各项性能已呈现出显著提升的态势，滤光片的国产化替代进程已全面开启。国内部分厂家采用国产滤光片制造的“实时定量PCR仪”和“基因测序仪”等荧光检测分析仪器，其性能具备了比肩国际一流企业产品的能力。相信随着国产滤光片设计制造等各项水平的不断提升，今后将有更多优秀的国产荧光检测分析仪器脱颖而出。