引　言

胰腺癌作为21世纪消化道中最为常见的恶性肿瘤之一，是癌症相关死亡的三大原因之一^[1]。在中国，胰腺癌发病率位居恶性肿瘤前十。根据《柳叶刀》杂志相关报道，胰腺癌确诊后五年内的生存率约为十分之一^[2]。为此，开展大面积的人口筛查与防治工作便尤为重要。

迄今为止，常见的胰腺癌检测方法如超声、电子计算机断层扫描（computed tomography, CT）与磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）在临床诊断上表现出良好的准确性^[3]，但受高昂的检测费用以及复杂繁琐的检验流程限制难以推广至社区家庭。此外，由于需专业人员操控设备与分析结果，患者往往不能在第一时间拿到检测结果，在筛查进程中占用很大的时间成本。

CA199作为一种与胰腺癌密切相关的肿瘤标志物^[4]，对胰腺癌敏感性最高。其存在于胰、胃、肺等组织结构中^[5]。在外周血液中，CA199浓度在 37 U/mL以下浮动变化。另一方面，CA199在胰腺癌的诊断上有较高的特异性，在鉴别良性与恶性病变方面表现良好^[6]。

免疫层析试纸条可利用免疫学原理，通过免疫学方法检测和鉴定样本中的目标标志物^[7]。其较低的检测成本与快速便携的特点，使得面向家庭的筛查成为可能。此外，借助量子点荧光纳米微球作为荧光探针标记肿瘤标志物，可以使得免疫层析试纸条的结果检测将不再依赖于大型且专业的检测设备^[8]。

然而，由于免疫层析试纸条容易受到复杂的体液样本基质干扰，尤其是全血样本中的红细胞会将纸基材料染成红色，强烈的可见干扰致使检测结果存在较大的误差^[9]。此外，血液中的黄疸、溶血酶等物质会产生自发荧光^[10]，降低传感信号质量，严重影响检测灵敏度。因此对于全血检测，有必要在液体到达免疫层析试纸条中的检测区域之前从全血样本基质中去除红细胞。从全血中分离血浆的传统方法，如离心、电渗流、介电泳和磁相互作用等^[11]，只能在配备精密仪器与专业人员的实验室进行，无法满足全血即时检测的需求。

微流控芯片又被称为微全分析系统，可以将生物、化学等实验集成在芯片上实现微流体操纵^[12-13]。由于其设计灵活且结构精细，在细胞分选、化学分析与检测领域微流控芯片有极大的发挥空间。因此，基于微流控芯片设计的微阵列过滤结构^[14-16]，不仅可以物理隔离样本中的红细胞，且不影响红细胞状态，从而避免了溶血的发生。

本研究设计了一种新型的微流控微阵列滤红结构用于滤除血液样本中的红细胞，并与免疫层析试纸条相结合，可有效识别量子点荧光纳米微球标记的CA199检测抗体。表征验证了量子点荧光纳米微球的稳定性与特异性，并进一步分析了微流控微阵列滤红结构在实际检测中的应用效果，为胰腺癌的家庭化筛查提供了一种全新的策略。

1 实验部分 1.1 试剂和仪器

实验中所用牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）购于中国北京索莱宝公司。三甲基氯硅烷、N−羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（磺基-NHS）与1−乙基−3−（3−二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（1−ethyl−3−(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC）购置于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。磷酸盐缓冲溶液（peptone buffered sbolution , PBS）购于武汉赛维尔生物科技有限公司。量子点荧光纳米微球−625由珈源量子点提供。样品垫与结合垫购于上海杰一生物技术有限公司，吸水垫与PVC底板由南京微测生物科技有限公司提供，硝酸纤维素膜购于上海赛多利斯公司。

实验中所用的主要仪器有苏斯MJB4光刻机（德国），Millipore超纯系统（德国），Beckman Coulter高速冷冻离心机（美国），超声波仪器（中国），Tecan Spark 多功能酶标仪（瑞士）。

1.2 微流控芯片制备

微流控芯片设计基于AutoCAD软件完成。硅片经前烘后，使用光刻机进行曝光。曝光后经后烘、显影流程完成对硅片图案化处理。使用三甲基氯硅烷对硅片表面进行修饰，将聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）预聚物溶液灌注至硅片表面，置于真空箱内充分排出预聚物中气泡，后转移至烘干箱中完成固化定型。剥离并切割所需PDMS芯片，将切割好的芯片结构置于异丙醇溶液中浸泡去除残留的三甲基氯硅烷，随后使用去离子水进行超声清洗。使用直径4.5 mm的圆冲预先打孔，使用等离子清洗机完成微流控芯片与玻璃基板的键合。

1.3 量子点荧光纳米微球标记CA199检测抗体

将10 μL量子点荧光纳米微球分散至MES溶液中，离心后分离上层清液，重新加入MES溶液并进行超声分散。分别配制10 mg/mL 的EDC溶液与NHS溶液，加入上述溶液中，充分混合后离心。离心结束后分离上层清液并加入1 mL抗体稀释液，与CA199检测抗体溶液混合后孵育1.5 h。孵育完成加入20%（质量体积比）BSA溶液封闭，再次离心后分离量子点荧光纳米微球，并复溶于含有10%（质量体积比）蔗糖、5%海藻糖与1% BSA的混合液中，置于4 ℃下保存备用。

1.4 微流控−免疫层析试纸条制备

免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、吸水垫、硝酸纤维素膜与PVC底板构成。首先将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，一端粘贴吸水垫，对应一端粘贴样品垫与结合垫。预先配制好含有0.1%蔗糖的PBS缓冲液稀释的山羊抗小鼠IgG溶液，使用滑膜喷金标机将上述溶液均匀预置在硝酸纤维素膜上形成C线，以同样过程处理CA199捕获抗体溶液形成T线。后置于37 ℃干燥箱中干燥后裁切为宽度均匀的免疫层析试纸条以备使用。将上述免疫层析试纸条插入微流控芯片所预先裁切留下的插槽中，对齐使样品垫与微流控芯片出液口紧密接触。

1.5 交叉反应验证

使用同批次免疫层析试纸条分别检测同水平下CA199，前列腺特异性抗原（prostate specific antigen, PSA），甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP），糖链抗原153（CA153），白细胞介素−8（interleukin−8, IL−8）与白细胞介素−10（interleukin−10, IL−10），在365 nm激发光下记录检测结果并使用ImageJ软件完成灰度值分析。

1.6 红细胞过滤效果检验

将稀释后的老鼠外周血液样本100 μL从入液口加入微流控芯片中，静置5 min，通过光学显微镜观察各区域红细胞密度并分析与所通过条形障碍阵列的数学关系。

1.7 微流控芯片对照实验

预先将微流控结构与免疫层析试纸条相结合，并另取等量免疫层析试纸条作为对照组。按照0，1 U/mL，2 U/mL，4 U/mL，8 U/mL浓度梯度使用10倍稀释的血液样本稀释CA199抗原。取配制好的上述溶液按照梯度等量滴入对照组中免疫层析试纸条的样品垫上，静置10 min后，在波长365 nm激发光下记录荧光信号强度。重复上述步骤，将溶液按梯度滴入微流控-免疫层析试纸条的芯片入液口，10 min后记录数据。使用ImageJ软件完成灰度值分析。

2 结果与讨论 2.1 表征分析

使用透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）观察量子点荧光纳米微球。由图1可以看出，纳米微球由多种量子点纳米材料所构成，微球的粒径范围约为100～200 nm。纳米微球在波长365 nm的激发光下，可产生波长625 nm的发射光（图2）。为此，量子点荧光纳米微球可在紫外光激发下，观察到较为明显的红光。

此外，标记后的纳米微球分散性质良好，且24 h后无明显的颜色或沉淀变化（图3（a）），说明该纳米微球悬浮液有较好的胶体稳定性。在多批次的量子点荧光纳米微球荧光信号检测中，其检测信号发光效果稳定（图3（b））。多方面证明量子点荧光纳米微球可在紫外光下裸眼观察荧光效果，其稳定性良好，可用于免疫层析试纸条的制备。

2.2 交叉反应

对于除CA199外不同抗原的结合位点，CA199捕获抗体与检测抗体表现出良好的特异性结合效果。如图4所示，在同浓度下的多种标志物溶液中，CA199免疫层析试纸条C线表现出差异性较大且强烈的荧光检测信号，其余样本溶液中检测信号远低于目标标志物。结果表明量子点荧光纳米微球标记的CA199检测抗体不存在明显的交叉反应，可应用于免疫层析试纸条的检测。

2.3 微流控微阵列滤红结构设计

为防止红细胞破裂发生溶血，致使细胞中血红蛋白等溢出，影响抗原抗体非特异性结合与荧光信号检测，本研究中微流控芯片采用了一种密集排列的条形阵列结构（图5），阵列间距随着通道延伸由12 μm不断缩小至8.4 μm，采用物理阻隔的方法去除血液样本中的红细胞。此外，由于阵列间距较小，纵横比高，且微流控芯片整体结构狭窄，毛细作用力同样可以促进血液样本向前扩散，最终流至与免疫层析试纸条相连接的部分，后续由吸水垫牵引完成样本检测。

由图6可以看出，随着通道的不断深入，条形阵列对于红细胞的阻隔效果越发明显，且未观察到破损的红细胞。经过五道阵列后，红细胞基本上已完全去除（图7），不再观察到高密度的红细胞。微流控微阵列滤红结构可以在5 min内完成100 μL样本过滤且不影响后续的免疫层析试纸条工作，可以满足过滤红细胞的实验需求。

2.4 微流控芯片−免疫层析试纸条

如图8和图9所示，检测样本首先经微流控芯片入液口进入微流控通道，在毛细力与压力作用下，样本通过微阵列区域，红细胞由于体积较大难以通过微流控滤红结构。在滤除绝大部分红细胞后，样本继续前进至免疫层析试纸条样品垫，随后在结合垫上，量子点荧光纳米微球标记的检测抗体与CA199发生特异性结合。层析作用下，样本中标记抗体与标志物所形成的复合物被C线上预置的包被抗体所捕获，最终形成三明治夹心结构。在波长365 nm紫外光照射下，可用肉眼观察到红色荧光。若样本中无目标标志物，则C线无明显荧光信号。样本中剩余的量子点荧光纳米微球标记的检测抗体继续前进至T线与山羊抗小鼠IgG相结合，最终可以在T线上观察到红色荧光。阳性样本在紫外光照射下最终可在免疫层析试纸条上观察到两条明显的红色荧光条带，而阴性样本仅可观察到一条荧光条带。

2.5 对照结果分析

在免疫层析试纸条与微流控芯片−免疫层析试纸条的对照实验中，如图10（a）所示，对照组中由于未增加滤红结构过滤样本中的红细胞，CA199与抗体结合效率降低，最终检测结果荧光信号强度大幅下降。此外，受样本中红细胞影响，免疫层析试纸条的检测区域背景信号较强，难以区分有效检测信号。而经微流控微阵列滤红结构过滤后的检测样本（图10（b）），免疫层析试纸条产生了显著且强烈的荧光检测信号（图11）。实验证明了微流控芯片对于免疫层析试纸条检测结果有显著的增强作用。

2.6 检测限计算

参照按倍比稀释的CA199标志物浓度所做出的荧光检测信号曲线，使用计算机进行Logistic4参数拟合，拟合曲线如图12所示。曲线相关系数R²=0.9999，与检测结果吻合良好。

检测限又称检出限，指的是系统对所需检测样品所能检测出来的最低浓度或者最小剂量，通常用零浓度下背景强度加上3倍的标准差进行计算。计算式为

$ f_{{\mathrm{LOD}}}={{C}\left(\frac{{A}-{D}}{{{I}}_{{{\mathrm{Blank}}}}+3{{\sigma }}_{{{\mathrm{Blank}}}}-{D}}-1\right)}^{\frac{1}{{B}}} $

(1)

式中：A，B，C，D为Logistic4参数拟合方程中所用参数；$ {I}_{{\mathrm{Blank}}}\mathrm{与}{\sigma }_{{\mathrm{Blank}}} $分别为平均响应以及从空白单位收集的背景强度的标准差。

通过式(1)计算得出，微流控芯片−免疫层析试纸条对于CA199的检测限为4.2 U/mL，低于临床检测限37 U/mL。检测限更低也有助于降低样本假阳性的概率。

3 结　论

简单高效地构建了方便快捷且稳定的微流控−免疫层析试纸条，其成本低廉，易于推广。其中微阵列滤红结构对过滤外周血液样本中的红细胞表现良好，显著降低了样本中红细胞的密度，且不会影响红细胞形态，避免了溶血的发生。量子点纳米荧光微球与CA199检测抗体结合所形成的复合物，仍然保持良好的特异性与稳定性，可准确识别样本中的目标标志物，检测结果可通过肉眼在紫外光照下定性判断。相较于未经滤红的血液样本，微流控−免疫层析试纸条检测出了显著的荧光信号，系统检测限为4.2 U/mL，低于临床诊断标准，为早期筛查提供了可能。然而检测指标单一难以为胰腺癌的诊断提供详细且具体的病患情况，与其他标志物如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）进行联合检测，将是值得探索且潜力巨大的研究方向。微流控−免疫层析试纸条操作简单且便于检测，无需借助专业的检测设备与工作人员，为胰腺癌普筛的家庭化进程提供了新型解决方案。