2024, Vol. 46
Issue (1): 15-22
膀胱癌是人类最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一，其发病率常年位于泌尿系统恶性肿瘤发病率的首位[1]。治疗膀胱癌可用的方法包括手术治疗、放疗、化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗和免疫治疗[2-4]。最新研究表明，细胞焦亡在泌尿系统恶性肿瘤的发生和发展中起着重要作用[5]。焦亡是一种炎症依赖性和自级联扩增类型的程序性细胞死亡，是激活局部免疫反应和提高抗癌功效的有效手段[6]。它涉及由Gasdermin家族蛋白调节的炎症过程，其特征是膜穿孔、细胞肿胀和细胞破裂[7]。化疗药物能激活Caspase-3蛋白并切割GSDME蛋白，N端片段穿透膜并破坏其渗透屏障，导致细胞焦亡，细胞内容物释放，激活免疫系统 [8]。焦亡水平还可作为膀胱肿瘤患者预后和生存的预测因素[9]。因此，细胞焦亡能为泌尿系统恶性肿瘤的治疗提供新的思路和治疗靶点，焦亡诱导剂的开发和应用具有很大的潜力。
大多数肿瘤细胞GSDME蛋白的表达远低于正常细胞，这归因于DFNA5基因启动子的甲基化[10]。联合使用去甲基化药物是上调GSDME蛋白表达的重要手段，它可以实现肿瘤细胞中GSDME蛋白沉默的逆转，促进焦亡现象的发生[11]。Fan等[12]使用去甲基化药物地西他滨与化疗纳米药物相结合的策略激活了GSDME蛋白介导的细胞焦亡。Cao等[13]使用去甲基化药物阿扎胞苷显著提高了细胞焦亡的发生率。Zheng等[14]使用去甲基化药物RG108联合铱基光敏剂诱导细胞快速焦亡，并重塑了肿瘤免疫治疗的微环境。RG108是一种非核苷的 DNA甲基转移酶抑制剂，能阻断 DNA 甲基转移酶的活性位点，引起抑癌基因的去甲基化和再激活，在调控GSDME蛋白方面具有巨大的应用价值[15]。
吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）是唯一被美国食品药品监督管理局、欧洲药品管理局及中国国家食品药品监督管理总局认证，可用于临床的近红外荧光染料[16]。ICG的吸收光谱和荧光光谱处于近红外区，其吸收波段在700～900 nm范围内，并在750～950 nm之间发射荧光[17]。ICG可通过低剂量近红外光激活诱导细胞质中Ca2+浓度的急剧升高，从而促进细胞色素c的释放，随后激活Caspase-3蛋白[18]。同时，ICG也是一种很有前途的可用于肿瘤光动力治疗（photo dynamic therapy，PDT）的光敏剂[19]。在PDT中使用ICG的主要缺点是：ICG具有不稳定性（水不稳定性、光降解和热降解）；ICG与脂蛋白能高度结合，这会导致其被迅速从体内清除掉[20]。因此，开发一种生物相容性好且能为ICG分子提供高效的水稳定性、光稳定性和热稳定性的材料意义重大。
根据细胞焦亡的原理，选取在近红外光下可激活Caspase-3蛋白的吲哚菁绿和去甲基化药物RG108来实现细胞焦亡。通过超声破碎的方法，将水相的牛血清蛋白包裹有机相的吲哚菁绿和RG108，形成新型的光促焦亡药物。通过一系列体外实验验证药物的生物相容性和对膀胱癌细胞的杀伤作用，为膀胱癌的治疗提供了一种全新的策略。
1 实验部分 1.1 试剂和仪器磷酸盐缓冲溶液（phosphate balanced solution，PBS）、RPMI 1640培养基、胎牛血清购自赛默飞公司，CCK-8试剂盒购自碧云天公司，Hoechst 33342细胞核染色试剂、Calcein-AM/PI双染试剂盒、SYTOX Green试剂盒购自东仁化学科技（上海）有限公司，吲哚菁绿、RG108购自美国MedChemexpress生物科技公司。
使用的仪器主要有：Tecnai-F20 s-twin型透射电子显微镜（美国），Shimadzu UV-2600紫外–可见漫反射光谱仪（日本），Tecan Spark 多功能酶标仪（瑞士），Carl Zeiss LSM 900激光共聚焦显微镜（德国）。
1.2 材料制备ICG/RG108@BSA是通过超声波辅助水包油乳化法组装的，这是形成和制备纳米级乳液的常用方法[21]。ICG和RG108在二氯甲烷（有机相）中溶解性良好，而牛血清蛋白在H2O（水相）中溶解性良好。将5 mg吲哚菁绿和1 mg的RG108溶于1 mL的二氯甲烷中，将30 mg的牛血清蛋白溶于去离子水中。在超声破碎作用下，两相形成了均匀的水包油乳液。将二氯甲烷用旋转蒸发仪蒸发去除后，再用0.7 μm玻璃纤维滤膜过滤乳液，得到ICG/RG108@BSA纳米材料。
1.3 材料形貌的表征用移液枪吸取10 μL的ICG/RG108@BSA溶液滴加到带有支持膜的铜网上，在室温下等待样品干燥，从而使其均匀地分散到支持网上。再用Tecnai-F20 s-twin型透射电子显微镜拍摄ICG/RG108@BSA材料的形貌和尺寸。
1.4 材料紫外吸收光谱的测定先用水溶液进行基线测试，然后再用去离子水将ICG/RG108@BSA原溶液稀释到合适的浓度，使用Shimadzu UV-2600紫外–可见漫反射光谱仪探测ICG/RG108@BSA的紫外吸收光谱。
1.5 细胞培养小鼠膀胱癌细胞（MB49）和人膀胱移行细胞癌细胞（T24）均用含有胎牛血清（体积分数为10%）以及双抗（体积分数为1 %）的RPMI 1640培养基培养，并于37 ℃、体积分数为5% 的CO2细胞恒温箱内培养。
1.6 细胞摄取实验本实验采用 Hoechst 33342染色液对细胞核进行定位，它在嵌入双链 DNA 后可以释放出强烈的蓝色荧光[22]。Mb49和T24细胞在共聚焦培养皿中培养过夜后，分别用100 µg/mL的ICG/RG108@BSA孵育1 h或24 h，然后用PBS清洗，并进一步用Hoechest 33342（1 µmol/L）孵育10 min，再用PBS清洗3次，然后使用共聚焦显微镜来观察不同时间段细胞的吞噬情况。
1.7 细胞毒性实验将T24细胞和Mb49细胞分别接种在不同的 96 孔板中，培养24 h后吸出孔内原有培养基，在不同的组别中分别加入新鲜培养基、20 µg/mL的 RG108以及100 µg/mL的ICG/RG108@BSA。使用755 nm激光器（激光功率密度为500 mW/cm2）照射各孔5 min后，将96孔板置于细胞恒温培养箱中继续培养24 h。将各孔中溶液替换为含CCK-8的培养基，其中CCK-8占细胞培养基体积的1/10。将96孔板放入37 ℃孵育箱内培养1 h后取出，放入Tecan Spark 多功能酶标仪，测量450 nm时的吸光度。
1.8 细胞死活染色将T24和Mb49细胞分别接种在共聚焦小皿中过夜。细胞贴壁后，每种细胞分别设置Control组、RG108组（100 µg/mL）、ICG/RG108@BSA组（100 µg/mL）3个组进行处理。每个小皿均使用755 nm激光器（500 mW/cm2）照射5 min。细胞处理24 h后，使用Calcein-AM/PI双染试剂盒将细胞染色10 min。用PBS清洗3次后，使用Carl Zeiss LSM 900激光共聚焦显微镜观察各组细胞。其中红色荧光代表死细胞，绿色荧光代表活细胞，用ImageJ软件进行荧光强度分析。
1.9 细胞焦亡形态表征将Mb49细胞和T24细胞分别接种到共聚焦培养皿中。待细胞贴壁后，分别用RG108（100 µg/mL）、ICG/RG108@BSA（100 µg/mL）处理Mb49细胞和T24细胞，其中Control组用新鲜培养基换液。每个小皿均使用755 nm激光器（500 mW/cm2）照射5 min。6 h后，用浓度为1 µmol/L 的SYTOX Green在黑暗培养箱中对膀胱癌细胞染色10 min。用PBS清洗3次后，各组细胞被置于共聚焦显微镜下以观测细胞的死亡情况和焦亡形态。
2 结果与讨论 2.1 ICG/RG108@BSA的形态表征利用透射电子显微镜对ICG/RG108@BSA的形貌和尺寸进行表征。如图1（a）所示，ICG/RG108@BSA呈现为规则均一的球状纳米颗粒，通过统计得到其平均粒径约为80 nm。如图1（b）所示，置于比色皿中的ICG/RG108@BSA呈现出清澈的绿色，且无明显沉淀物，证明该材料具有优异的水溶性，在水中分散良好。由此可知，ICG和RG108被BSA成功包裹，可以用于后续实验。
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图 1 ICG/RG108@BSA的形态表征图 Figure 1 Morphological characterization of ICG/RG108@BSA |
如图2所示，ICG/RG108@BSA的紫外–可见光（UV-vis）吸收光谱显示其在700～800 nm之间具有较强的光吸收能力。该波段的光相对于可见光在组织内穿透力更强。近红外光在组织的吸收、散射和自发荧光背景都比较低，且穿透组织深度较其他波段光更深，对生物体造成的光损伤小[23]。本文选取的755 nm近红外激发光源可以有效匹配材料的吸收光谱性能。
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图 2 ICG/RG108@BSA的紫外–可见吸收光谱图 Figure 2 Ultraviolet and visible spectrum of ICG/RG108@BSA |
为了验证近红外激发下ICG/RG108@BSA的治疗效果，使用人膀胱移行细胞癌细胞T24以及小鼠膀胱癌细胞Mb49进行了体外验证。细胞摄取足够的材料, 可有效增加光动力治疗的效率[24]。首先验证了T24以及Mb49细胞对ICG/RG108@BSA的吞噬效果。ICG在共聚焦激光的激发下会被探测到红色荧光，可用于观测材料在细胞中的相对位置[25-26]。结果如图3所示，与ICG/RG108@BSA溶液共孵育24 h后，T24和Mb49细胞在共聚焦激光激发下被探测到明显的红色荧光，且该荧光比仅共孵育1 h组更亮。由此可见，所制材料具有良好的生物相容性，且在细胞内能够稳定存留24 h，并能维持其性能。同时也证明，T24和Mb49细胞对ICG/RG108@BSA具有良好的吞噬效果。
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图 3 膀胱癌细胞对ICG/RG108@BSA的吞噬图 Figure 3 Cell uptake images of ICG/RG108@BSA |
进一步探究了膀胱癌细胞内的ICG/RG108@BSA在激光照射下是否会对肿瘤细胞产生杀伤作用。结果如图4所示，ICG/RG108@BSA在755 nm激光激发下，对膀胱癌细胞具有一定的杀伤效果。其中，当ICG/RG108@BSA质量浓度为100 µg/mL时，在激光照射下，Mb49细胞存活率为6.9%（见图4（a）），T24细胞存活率仅为10.7%（见图4（b）），说明ICG/RG108@BSA对癌细胞具有很强的细胞毒性。此结果在一定程度上验证了ICG/RG108@BSA可用于人膀胱癌以及小鼠膀胱癌的治疗。
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图 4 膀胱癌Mb49和T24细胞的存活率 Figure 4 Cell viability assay of Mb49 and T24 cells |
Calcein-AM通常与死细胞荧光探针碘化丙啶（PI）结合使用，对活细胞和死细胞进行双重荧光染色，以确定细胞的状态[27]。如图5（c）和（g）所示，Mb49细胞和T24细胞的ICG/RG108@ BSA组红色荧光均较强，绿色荧光较弱，证明有大量的Mb49细胞和T24细胞死亡。而在Control组和RG108组中几乎没有观察到红色荧光，只探测到绿色荧光，证明这些组别中细胞存活状态良好（见图5（a）,（b）,（e）和（f））。由荧光定量分析结果可知，ICG/ RG108@BSA材料和光刺激共同作用下的Mb49细胞的红色荧光强度约为其他组的8倍（见图5（d）），ICG/RG108@ BSA材料和光刺激共同作用下的T24细胞的红色荧光强度约为其他组的15倍（见图5（h））。因此，活/死细胞的染色结果证实了光刺激的ICG/RG108@BSA材料能有效地杀死膀胱癌细胞，这与CCK-8检测的结果一致。
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图 5 活/死细胞染色共聚焦荧光图 Figure 5 Confocal fluorescence images of live-dead cell staining |
绿菁SYTOX是一种死细胞核酸染料，在焦亡图像拍摄时被用来定位死细胞位置[28]。在488 nm激光激发下它会产生明亮的绿色荧光，因此通常可用绿色荧光来指示死亡细胞[29]。图6是共聚焦显微镜下拍摄的所有组别细胞中的绿菁SYTOX染色情况和形态表征。ICG/RG108@BSA组中出现了大量绿色荧光（见图6（c）和（g）），而Control 组和 RG108组中并没有出现绿色荧光（见图6（a），（b），（e）和（f）），说明经过 755 nm激光照射之后，ICG/RG108@BSA表现出了细胞杀伤性，导致膀胱癌细胞死亡。在共聚焦显微镜明场的视野下，Control 组和 RG108组中的细胞形态都没有发生明显变化，而如图6（d）和（h）所示，ICG/RG108@BSA组细胞在光照6 h后形态发生了显著变化。在ICG/RG108@BSA组可以明显观察到Mb49细胞和T24细胞均呈现出肿胀状态，细胞膜与细胞内容物出现分离的趋势，表现出典型的焦亡细胞形态，其中红色箭头指向的是已发生焦亡的细胞。由此可见，制作合成的 ICG/RG108@ BSA在光激活下能够诱导膀胱癌细胞Mb49和T24发生焦亡，并使细胞产生显著的细胞毒性。
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图 6 膀胱癌Mb49和T24焦亡形态表征 Figure 6 The characterization of pyroptosis of Mb49 and T24 cells |
通过超声波辅助水包油乳化法，用牛血清蛋白组装了吲哚菁绿（ICG）与去甲基化药物RG108，合成了新型纳米材料ICG/RG108@BSA。该材料在700～800 nm的近红外波段内具有优异的光吸收能力。细胞吞噬实验证明了其出色的生物相容性和细胞内的稳定性，这可有效避免药物的失效。细胞毒性实验和细胞活/死染色实验证明了近红外激发下的ICG/RG108@BSA材料对于膀胱癌细胞Mb49和T24的杀伤效果十分显著。755 nm激光可以诱导经ICG/RG108@BSA材料孵育的膀胱癌细胞发生焦亡，有利于激活免疫反应。该研究结果在膀胱癌治疗领域具有十分广阔的应用前景。
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