引　言

神经系统疾病的精准诊断对临床诊断工具提出了越来越高的要求，迫切需要一种既可以高分辨成像又可以深层成像的辅助诊断工具。双光子技术是常用的深层成像技术，最深可达1 mm，但分辨率只有300～500 nm，对于神经细胞中类似树突棘等亚细胞结构成像仍然存在局限性^[1]。受激发射损耗（STED）超分辨成像的分辨率可达50 nm以下，但只能用于30 μm以内浅表层成像^[2]。因而将双光子成像和STED成像结合形成的双光子STED复合显微镜则既可以实现超高分辨成像，也可以实现深层成像。

德国的Moneron等^[3]于2009年首次把双光子荧光显微技术与STED显微技术结合，搭建了第一个双光子STED显微系统，将1060 nm的飞秒激光器作为双光子激发光源，676 nm的连续激光器作为STED光源，得到了荧光标记的转录调节因子三维分布。2009年，加拿大的Li等^[4]使用两束脉冲激光实现了双光子STED成像，他们使用两台锁相同步钛蓝宝石飞秒激光器分别用于双光子激发和受激发射损耗，获得了分辨率小于 50 nm的中国仓鼠卵巢细胞图像。2011年，法国的Scheul等^[5]仅用一台脉冲激光器，通过一块偏振晶体将脉冲光分为双光子光源和STED光源。2013年，法国的Bethge等^[6]用双光子STED显微镜实现了对脑切片的双色成像。2016年，意大利的Hernandez等^[7]采用了门控探测技术，结合多图的反卷积算法，提高了系统成像质量。

国内在双光子STED成像方面的研究起步较晚，但进展较快。2014年，天津大学研究组用一台钛蓝宝石激光器进行了双光子STED实验^[8]。2016年，苏州医工所采用钛宝石飞秒激光器和OPO泵浦，实现了双光子STED超分辨成像

双光子STED复合显微成像技术对深层生物组织成像具有较大的优势，在神经疾病临床诊断及脑科学研究方面具有广阔的应用前景，但该技术大都还处于方法研究的实验阶段，系统功能和集成稳定性等都无法满足临床实际要求^[9-13]。对此本文自主研制了双光子STED复合显微镜成像系统，并对其成像特性进行了研究。

1 复合显微镜成像系统

双光子STED复合显微镜系统如图1和2所示，主要包括五个部分：入射激光①、光束合束选通模块②、扫描模块③、荧光探测模块④和正置荧光显微镜⑤。

扫描模块③与正置荧光显微镜⑤构成一个整体，该正置显微镜内分三层，包括透射照明光路、荧光入射照明光路、目视观察光路，可以实现普通宽场荧光显微镜的基本功能。图2最上层38为三目头筒镜，用于目镜目视观察或宽场成像；中间层35为宽场荧光照明层，36为聚光透镜，37为荧光照明光纤头；下层为扫描模块；34为显微物镜。

2 双光子STED复合显微成像技术研究 2.1 多波长选通

1） 激发波长选通

入射激光部分主要包括宽波段连续谱激光器和双光子成像激光器。宽波段连续谱激光器为皮秒脉冲激光，脉宽为100 ps左右，光谱范围为450～1700 nm，用于红绿双色荧光成像和STED超分辨成像，经光纤传导并准直输出。双光子成像激光器提供用于双光子成像的高能量飞秒脉冲激光，脉宽为100 fs，波长为780 nm，光束直径为1.2 mm并准直输出。

采用Chroma公司的ZT532RDC-XT二色镜对入射光进行分光，其中592 nm和780 nm波长激光的透射率为大于95%，而488 nm波长的激光被反射，从而入射激光被该二色镜分为激发光和STED损耗光两路并被分别调制。对于不同的成像方式，采用了不同的激光和滤光片组合。

■ 绿色荧光扫描成像：采用宽波段连续谱激光器作为激发光源，并用一个中心波长为488 nm、波长带宽为10 nm的带通滤光片滤出所需要的激发光。

■ 红色荧光扫描成像：采用宽波段连续谱激光器作为激发光源，并用一个中心波长为561 nm、带宽为24 nm的带通滤光片滤出所需要的激发光。

■ 双光子成像：采用双光子成像激光器作为激发光源，该激光器发出的780 nm飞秒激光能够透过二色镜和滤光片进入到后续光路中，为系统提供双光子成像需要的激发光。

■ STED超分辨成像：损耗光采用中心波长为592 nm、带宽为50 nm的激光束，并用滤光片提供所需要的损耗光束。

2） 红绿荧光探测滤波

本文复合显微镜可以实现红色和绿色双色荧光通道成像，红绿荧光选择则根据需要在扫描模块中切换相应的二色镜及滤光片来实现。

■ 绿色荧光成像时：使用绿色荧光成像二色镜26.1，其作用是透过488 nm、592 nm、780 nm的入射激光，并使其入射到样品上，而将525 nm荧光信号光反射给探测模块。与其配合使用的绿色荧光成像滤光片28，其通光范围中心波长为525 nm，带宽为50 nm，该绿色荧光滤光片可手动切入或切出光路。

■ 红色荧光成像时：使用红色荧光成像二色镜，其作用是透过561 nm的入射激光，使其入射到样品上，而将620 nm荧光信号光反射给探测模块。与其配合使用的红色荧光滤光片，其通光范围是590～650 nm（红色荧光滤光片和红色荧光二色镜作为一个组件集成在一起）。

绿色荧光成像二色镜和红色荧光成像滤光片组件（二色镜、滤光片）设置在一个可手动切换位置的可移动滑轨上。当进行绿色荧光扫描成像时，将绿色荧光滤光片切入到光路中，当进行红色荧光扫描成像时，将该滤光片切出光路。

2.2 多光束合束

本系统涉及三路激光光束，两束来自超连续谱激光器分光，一束来自双光子飞秒激光器。双光子STED复合成像则需要将三路激光经物镜后聚焦于同一点上，因此，首先要对系统进行多光束合束的精密调节，采用电控可调俯仰的二色镜机构可方便监测和调整光束精密合束。

对于STED成像，其损耗光的最小光强处应与激发光的最大光强处精确重合。这样，可使外围荧光被较强损耗，而中央较强荧光被保留，以达到较好的超分辨效果。我们采用直径为60 nm的金纳米颗粒和精密三维纳米位移台，分别用488 nm和592 nm两束光对金粒子样本进行成像，利用位移台对其进行扫描，探测金粒子背向散射光并进行成像，以此来测定激光聚焦点点扩散函数，评价系统性能，指导系统装调。金粒子成像结果如图3所示，激发光与损耗光在物镜焦点附近实现了XY平面的精确重叠，重合精度可达20 nm，满足系统成像要求。

当488 nm和592 nm激光合束完成以后，关闭488 nm激光并打开780 nm双光子激光，采用同上的金粒子扫描成像方法，通过调节反射镜，将780 nm激光调节至与592 nm激光重合，最后达到三路激光均精密重合的目的。

2.3 关键性能指标测定

1） 双光子成像深度

双光子成像深度是指双光子可以清晰成像的最大深度。测试过程中使用琼脂糖包裹的荧光微球作为成像标本，用双光子方式对其进行成像，样本成像深度位置是通过在竖直方向移动样本来实现，并采用千分表对移动行程进行测量，继而测量出成像清晰的深度。对两个不同深度位置成像时，千分表对应的读数为199.5 μm和908.5 μm，对应双光子图像均清晰可见，如图4所示，因此对应的成像深度为709.0 μm。

2） STED成像横向分辨率

横向分辨率是指显微镜成像在水平面（XY面）内的分辨能力。业内均采用测量荧光微球成像的半高全宽评价此类显微镜的横向分辨率。测试时使用荧光微球作为样本，通过移动纳米位移台实现对样品扫描成像，并设置扫描步距为20 nm。由于荧光微球存在尺寸不均一以及团聚的现象，微球的成像点大小不一，其中较小的点代表双光子STED显微镜的分辨率。测算强度曲线半高全宽在X方向上对应的像素数，得到横向分辨率约为58 nm，如图5所示。

2.4 系统成像研究

在各个模块研制完成的基础上，对系统进行集成，组装集成后形成了一个完整的显微镜样机，如图6所示。样可以实现包括共聚焦显微成像、双光子显微成像、STED超分辨成像等在内的多种模式成像，并可在成像模式间互相切换。

经实验可知，双光子STED复合显微镜样机成功实现了红绿双色荧光扫描成像、荧光原位杂交技术（FISH）成像、对鼠脑神经纤维的双光子成像以及对皮肤组织的无标记二次谐波成像。此外，通过三维平移台改变样品垂直方向上的高度，还实现了深层成像和分层成像，如图7～10所示。

对48 nm直径荧光微球分别进行荧光扫描成像和STED超分辨成像，从成像效果中可以明显看出，荧光扫描图像中很多微球团聚在一起无法分辨，而STED成像却可以清晰分辨，说明成像分辨率有明显的提升，如图11所示。

3 结　论

双光子STED复合显微镜在深层生物组织成像方面具有较大的优势，在神经疾病临床诊断及脑科学研究方面具有广阔的应用前景。本文对双光子STED复合显微成像中相关技术进行了研究，采用多滤光片组合与切换的方式实现了488 nm、561 nm、592 nm和780 nm多波长激光的选通及红绿双通道荧光探测。采用金粒子扫描成像的方法实现了双光子、激发光、STED损耗光多光束精密合束，重合精度约为20 nm，探讨了系统成像深度、STED成像分辨率的定量检测方法。该复合显微镜可以对荧光标记的样本进行扫描成像，具备红绿双色荧光扫描成像功能、双光子绿色荧光成像功能和STED超分辨绿色荧光成像功能。一般采用双色荧光扫描成像即可完成染色体等的荧光成分分析或进行FISH成像，对于较厚的样本可以采用双光子深层成像，对于要求较高分辨率的情况可以采用STED超分辨成像。经测试可得，系统的成像深度达到700 μm，STED成像分辨率优于60 nm。在完成双光子STED复合显微镜系统研制的基础上，接下来我们将对该系统开展在临床上的应用研究。