2020, Vol. 42
Issue (3): 9-14
荧光技术的应用几乎涉及了生活的方方面面。材料荧光技术在工业、能源、生物医药、环境监测、军事领域等均扮演着极其重要的角色。新技术、新产品的不断涌现，对该类产品的核心参数荧光量子产率的测量也提出了越来越高的要求。
荧光量子产率是表示一个物质荧光特性的重要参数，它表示物质发射荧光的效率，通常用ϕ表示。其定义为物质发射荧光的总能量与吸收能量之比，也就是处在电子激发态的分子发射荧光的概率。因此，量子产率只能小于或等于1。
量子产率的测定方法有相对法和绝对法两种[1]。20世纪50年代前后，大多使用绝对法来测定量子产率。早期的绝对量子产率测定方法较繁琐，设备复杂，容易引入误差，所以无法形成商品化仪器[2]。后来科研人员大多使用相对法进行量子产率的测定。相对法依赖于已知量子产率的物质作为测定标准，再分别用荧光分光光度计和紫外可见分光光度计，测定标准和试样的真实发射光谱和激发波长的光密度，就可以推算出试样的量子产率。相对法测量量子产率对设备要求低，无需专用测试系统，但其也有明显的局限性，比如，当测定标准和试样的激发光谱差异较大时，就会引起较大的测量误差[2]。
21世纪初，美国NIST研制了一台高精度的荧光光谱仪器，荧光的测量进入了精密测量的阶段[3]。随着技术的发展，出现了几种较为便捷的绝对量子产率测试方法[4]。这些方法的仪器装置各有不同，测量结果的准确性也不同。加拿大国家计量局采用标准光谱辐射计校正入射光光谱功率分布，结合标准探测器和标准物质进行绝对量子产率测试[5]。该方法精度很高，但装置复杂，无法大规模普及应用。积分球技术的引入，再结合激发光谱和发射光谱的双光谱法进行绝对量子产率测量，这类方法[6-8]的出现有效降低测量装置的复杂性，为量子产率测试仪器的普及提供了一定的理论依据。
国外主要的荧光仪器公司均已推出商品化的绝对荧光量子产率测试系统。绝对量子产率测定法可直接对待测试样的量子产率进行测定，对荧光材料的研制有着重大的意义。
随着我国现代化进程的发展，对各类科研分析仪器的需求与日俱增。研制国产绝对荧光量子产率测量系统，将终结这一领域长期依赖国外产品的历史，同时降低检测成本，使得更多的实验室都用得起、用得上荧光量子产率测量技术，促进我国新材料等领域更高速的发展。
1 系统设计绝对荧光量子产率测量系统主要包括荧光分光光度计、积分球[9]、标准钨灯、标准电源、量子计数器和荧光量子产率分析软件组成。整机系统如图1所示，系统结构框图如图2所示。
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图 1 绝对荧光量子产率测量系统 Figure 1 Absolute fluorescence quantum yield measurement system |
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图 2 绝对荧光量子产率测量系统结构框图 Figure 2 Structural block diagram of absolute fluorescence quantum yield measurement system |
系统按以下步骤获取样品的荧光量子产率：第一步，利用罗丹明B量子计数器和标准钨灯光源对荧光分光光度计进行光谱校正；第二步，分别将空白样品和荧光样品置入积分球内部样品池中，测量包含激发瑞利散射光谱在内的空白样品和荧光样品的发射光谱；第三步，利用荧光量子产率分析软件自动计算样品的荧光量子产率数据。
1.1 仪器的光路设计系统光路示意图如图3所示。系统光源选用氙灯，氙灯发出的复合光经过激发单色器分光后形成单色光，单色光照射到样品表面，样品的散射光以及被激发出的荧光在积分球内部进行多次反射和累积，累积后发射光经过发射单色器分光后到达光电倍增管探测器，被探测器接收。激发单色器和发射单色器分光系统均采用凹面光栅形式。样品置于积分球内部，由样品位置反射或发射出的各种光，积分球都对其进行收集和累积，因此，具备了直接计算绝对荧光量子产率的基础。
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图 3 绝对荧光量子产率测量系统光路图 Figure 3 Optical path map of absolute fluorescence quantum yield measurement system |
由于受到光源、单色器和探测器等的光谱特性的影响，由仪器直接记录的荧光光谱并不是所测量物质的真实光谱，这样的光谱被称为未校正光谱，这种光谱的形状和最大发射峰位置等与真实光谱都有一定的区别。在对物质进行荧光量子产率测量时，就必须对所使用的荧光分光光度计仪器进行光谱校正，获取物质的真实光谱，才能得出准确的荧光量子产率[10]。
本系统采用罗丹明B量子计数器和标准钨灯光源两种方式，对荧光分光光度计进行光谱校正。
1.3 激发光谱校正仪器的激发光谱能量在不同波长下并不是一个恒定值，而是受到光源和激发单色器等的影响，有一个分布特征曲线。只有消除了这个曲线的影响，才能得到物质本身的真实激发光谱。
| $ {S_{{\rm{ex}}}}\left( \lambda \right) = {S'_{{\rm{ex}}}}\left( \lambda \right)/G\left( \lambda \right) $ | (1) |
式中：Sex（λ）为物质的真实激发光谱；
对激发光谱进行校正就是要得到G（λ）系数[11]。罗丹明B量子计数器标准溶液在激发波长250～600 nm波长范围内具有吸收恒定、量子产率不随波长变化，激发光谱为水平直线的特性[11]，如图4所示。将罗丹明B量子计数器放入测量光路中，如图5所示。仪器发射波长固定在640 nm，执行250～600 nm的激发光谱扫描，此时得到的激发光谱便是G（λ）。
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图 4 量子计数器标准溶液的激发光谱特征 Figure 4 Excitation spectrum characteristics of standard solution of quantum counter |
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图 5 激发光谱校正示意图 Figure 5 Excitation spectrum correction diagram |
仪器的发射光谱受到发射单色器、光电倍增管和积分球等的光谱特征影响，直接记录得到的发射光谱为未校正的发射光谱。需要消除这些光谱特征的影响，才能得到物质的真实发射光谱。
| $ {S_{\rm em}}\left( \lambda \right) = {S'_{{\rm{em}}}}\left( \lambda \right)/M\left( \lambda \right) $ | (2) |
式中：Sem（λ）为物质的真实发射光谱；
对发射光谱的校正就是要得到M（λ）系数[11]。校正方法是清空积分球中的样品，仪器执行等波长差同步扫描，扫描波长范围为250～600 nm，如图6所示。这样就可以获得250～600 nm仪器发射光谱综合响应特征系数M（λ250～600），即
| $ M\left( {{\lambda _{250 \sim 600}}} \right) = I\left( \lambda \right)/G\left( \lambda \right) $ | (3) |
式中：M（λ250～600）为250～600 nm仪器发射光谱综合响应特征系数；I（λ）为250～600 nm等波长差同步扫描光谱；G（λ）为仪器激发光谱综合响应特征系数。
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图 6 发射光谱校正示意图（250~600 nm） Figure 6 Emission spectrum correction diagram（250~600 nm） |
对于600 nm以上的波长范围，通过已知色温数据的标准钨灯光源作为黑体来求得发射光谱校正曲线[12]，如图7所示。校正方法是将标定过色温数据的钨灯放入样品室，调整标准电源达到标准钨灯的标定电流工作模式，使标准钨灯达到已知的色温状态。仪器执行发射波长扫描，扫描波长范围为600～900 nm。此时得到的光谱为W（λ）。这样就可以获得600～900 nm仪器发射光谱综合响应特征系数M（λ600～900），即
| $ M\left( {{\lambda _{600 \sim 900}}} \right) = W\left( \lambda \right)/H\left( {\lambda ,T} \right) $ | (4) |
式中：M（λ600～900）为600～900 nm仪器发射光谱综合响应特征系数；W（λ）为600～900 nm发射波长扫描光谱；H（λ,T）为色温T时的黑体辐射曲线；T为标准钨灯的色温。
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图 7 发射光谱校正示意图（600~900 nm） Figure 7 Emission spectrum correction diagram（600-900 nm） |
荧光量子产率测量系统采用绝对法测定方式，是对积分球测量得到的荧光物质的真实荧光光谱直接进行计算的方法。因为样品散射出的光大部分都被积分球收集并进入荧光分光光度计的发射单色器中，所以可以使用光谱中的峰面积数据代替样品散射出的光子数进行计算。与荧光量子效率相关的变量有吸收率、外量子效率和内量子效率，内量子效率即为荧光量子产率的定义。仪器经过光谱校正后，分别测量空白样品和荧光样品的真实发射光谱，如图8和图9所示，计算方法如式 (5) ～ (7)。新研制的荧光量子产率分析软件可自动计算得出样品的量子产率数值，如图10所示。
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图 8 空白样品真实光谱图 Figure 8 Real spectrogram of blank sample |
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图 9 荧光样品真实光谱图 Figure 9 Real spectrogram of fluorescent samples |
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图 10 荧光量子产率分析软件界面 Figure 10 Software interface for fluorescence quantum yield analysis |
| $ A = {E_{{\rm{in}}}}/{E_{{\rm{ex}}}} = \left( {{R_{{\rm{ex}}}} - {Y_{{\rm{ex}}}}} \right)/{R_{{\rm{ex}}}} $ | (5) |
| $ {Q_{{\rm{ex}}}} = {E_{{\rm{em}}}}/{E_{{\rm{ex}}}} = \left( {{Y_{{\rm{em}}}} - {R_{{\rm{em}}}}} \right)/{Y_{{\rm{ex}}}} $ | (6) |
| $ {Q_{{\rm{in}}}} = {E_{{\rm{em}}}}/{E_{{\rm{in}}}} = \left( {{Y_{{\rm{em}}}} - {R_{{\rm{em}}}}} \right)/\left( {{R_{{\rm{ex}}}} - {Y_{{\rm{ex}}}}} \right) $ | (7) |
式中：A为样品吸收率；Ein为样品吸收的光子数；Eex为样品激发的光子数；Rex为空白样品激发波长区域峰面积值；Yex为荧光样品激发波长区域峰面积值；Qex为外量子效率；Eem为样品发射的荧光光子数；Yem为荧光样品荧光波长区域峰面积值；Rem为空白样品荧光波长区域峰面积值；Qin为内量子效率，即荧光量子产率。
3 实验验证利用绝对荧光量子产率测量系统，对已知荧光量子产率的物质进行测量验证，测试结果如表1。对比测试结果表明，新研制的荧光量子产率测量系统所得出的物质荧光量子产率数据与传统参考文献的数据基本一致，且在不同的测试波长范围内均能保持较高的准确性。
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表 1 荧光量子产率测试数据 Table 1 Fluorescence quantum yield test data |
研制的国产绝对荧光量子产率测量系统，主机采用国产F98荧光分光光度计，样品光路设计采用积分球技术，光谱校正采用量子计数器和标准钨灯方式，配合荧光量子产率分析软件，可实现对物质荧光量子产率的绝对法测量。用已知量子产率的标准物质进行验证，结果表明，系统的测量准确性较高，可满足大部分荧光物质的测试要求。系统的研制使我国在绝对荧光量子产率测量方面取得重要进展，是目前国内首个实现商品化的荧光量子产率测量系统。
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