引　言

肝癌分为原发性和继发性两大类，其中原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界排名第6位的常见恶性肿瘤，其致死率世界排名第3位^[1]。目前，手术切除仍然是临床肝癌治疗的主要手段，但即使是彻底性切除，5年内转移复发的概率仍高达60%～70%^[2]，转移复发已成为提高肝癌生存率的瓶颈^[3]。临床的转移是一个不断复制筛选的过程，这种筛选使有转移潜能的细胞数量增多。在筛选过程中，出现了一些具有不同转移潜能的癌细胞，转移潜能大的癌细胞和转移潜能小的癌细胞在形态结构和基因表达上有明显的差异性^[4]。对不同转移潜能的肝癌细胞的检测，对抑制和预测癌症的转移复发有重要的临床意义。

目前，肝癌检测的金标准仍然是病理分析，但是，随着计算机技术和生物医学技术的发展和应用，出现了许多新的检测手段，例如：超声探测根据回声的不同可以检测组织病变情况；CT扫描和磁共振成像可以对肿瘤进行快速检测。但这些手段不能呈现细胞水平的图像，而光学检测以其非侵入、非接触的优点为临床诊断和活体细胞的研究提供了更有利的工具^[5]。内窥式激光共聚焦显微镜^[6]、内窥式光学层析成像（OCT）^[7]可以在细胞水平区分正常组织和癌变组织，这两种光学技术在无标记条件下，都是基于光散射的探测。细胞的复杂结构是光散射的主要来源，可以采用散射显微光谱对细胞进行识别^[8]。本文使用前期搭建的光纤共焦后向散射（fiber confocal back-scattering, FCBS）显微光谱检测了正常肝细胞和不同转移潜能的肝癌细胞的后向散射显微光谱，再分别结合统计数据分析和机器学习算法对其进行自动分类、识别。

1 实验方法 1.1 主成分分析法

主成分分析（PCA）是一种常用的数据分析方法，目的是对原始数据进行降维，把原本相关性很高的变量转换为较少几个彼此互相独立不相干的变量，这几个变量包含了原始数据的主要信息，称为主成分^[9]。由于所采集的光谱数据采样间隔是纳米或亚纳米，一条光谱曲线是维数较高的二维数据。PCA可以把高维数据映射到低维空间，解决因为维数过多计算量大的弊端。

PCA的算法步骤如下：

设光谱数据为 $ \left\{ {{{\rm{\alpha }}_1},{\alpha _2},{\alpha _3}, \cdots ,{\alpha _n}} \right\}$ ，组成样本矩阵α，对其中每一个样本数据标准化处理：

$ {\rm{\alpha }}\left( {\rm{\lambda }} \right) = \frac{{{\alpha _{{i}}} - {\alpha _{\rm{{min}}}}}}{{{\alpha _{\rm{{max}}}} - {\alpha _{\rm{{min}}}}}} $

(1)

式中： $ {\rm{\alpha }}\left( {\rm{\lambda }} \right)$ 为归一化后的光谱数据；α_max和α_min分别为光谱数据每一个样本的最大值和最小值。计算样本矩阵α的协方差矩阵：

$ {{c}} = {\rm{cov}}\left( \alpha \right) = \left[ {\begin{array}{*{20}{c}} {{c_{11}}}& \cdots &{{c_{1n}}}\\ \vdots & \ddots & \vdots \\ {{c_{n1}}}& \cdots &{{c_{nn}}} \end{array}} \right] $

(2)

将c的特征值从大到小排列，组成特征值矩阵，取前k个特征值，一般累积贡献率要大于85%^[10]。

1.2 支持向量机

支持向量机（support vector machine，SVM）在解决小样本、非线性和高维数据方面具有特殊的优势。SVM主要用于定性分类、定量回归和预测，近年来在生物医学、图像处理、模式识别等方面得到了广泛的应用^[11]。

SVM的目标是寻找到一个最优超平面使得每类样本与超平面之间的间隔最大，从而对样本实现分类。分类超平面表示为：

$ {{{\omega }}\rm^T}x + b = 0 $

(3)

式中：ω为超平面的法向量；b为常数，表示数据直线拟合的截距。每类数据到最优超平面的几何间隔为 $ 1/\left\| {{\omega }} \right\|$ ，由此寻找最优超平面，等价于最小化 $ 1/2{\left\| {{\omega }} \right\|^{2}}$ 。为了解决最小化问题，引入Lagrange函数，转化为对偶问题：

$ {\cal L}\left( {{ \omega} ,b,{\alpha} } \right) = \frac{1}{2}{{\left\| {{\omega}} \right\|} ^2} - \mathop \sum \limits_{i = 1}^n {\alpha _i}\left( {{y_i}\left( {{{\omega} ^{\rm{T}}}{x_i} + b} \right) - 1} \right) $

(4)

式中α_i > 0为Lagrange乘数。求解对偶问题，首先固定 α，让 ${\cal L} $ 关于ω和b最小化，分别对ω和b求偏导数使其等于零,代入后得到：

$ \begin{split} &\mathop {\max }\limits_\alpha \mathop \sum \limits_{i = 1}^n {\alpha _i} - \frac{1}{2}\mathop \sum \limits_{i,j = 1}^n {\alpha _i}{\alpha _j}{y_i}{y_j}\left( {{x_i} \cdot {x_j}} \right)\\ &{\rm{s}}.{\rm{t}}.\;\;\;\;\mathop \sum \limits_{i = 1}^n {\alpha _i}{y_i} = 0\;\;\;{\alpha _i} \geqslant 0,\;i = 1, \cdots ,n \end{split} $

(5)

对于线性不可分的样本，SVM的方法是把输入向量投射到更高维度，在更高维度实现线性可分，找寻最优分类超平面。

虽然SVM是一个二分类器，对于多分类，SVM的实现方式有两种：一对多或一对一。本文所用工具包为台湾林智仁教授撰写的libsvm库^[12]，libsvm库使用的是多对多的方法。即给定m个类，每两个类训练一个二分类器，总分类器个数为m（m−1）/2个，每个分类器对样本进行投票，以最终票数结果作为分类结果^[13]。

2 实验装置和材料 2.1 实验装置和样品

本实验采用已在早期的文献中报道的FCBS光谱仪^[8]，主要的检测原理是结合了光纤共焦显微成像和弹性散射光谱技术，可以同时提供单个细胞的背散射光谱和图像。整个系统如图1所示，由宽带光源、准直镜、光纤耦合器、光学探头、光谱仪和主控电脑组成。在400～1 000 nm范围内响应良好，光谱分辨率为4 nm。

实验所用的人正常肝细胞株（L02）、低转移潜能肝癌细胞株（MHCC97-L）和高转移潜能肝癌细胞株（HCCLM3)样本共69例，如图2所示，均由复旦大学附属中山医院肝癌研究所提供。细胞均在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中生长，培养条件为37 ℃、CO₂体积分数为5%的细菌培养箱中培养。所有细胞植株均在直径为35 mm的培养皿中以低传代数（<10⁵个细胞/mL）培养。培养时间大约为12 h，最终植株稳定粘附在培养皿上。

2.2 实验方法和步骤

FCBS基于共焦理论，利用光纤耦合器的单模光纤将光源照射到样品，并在焦点处接收回来的散射光。光纤端面同时作为点光源和点探测，实现了共焦探测。把带有贴壁细胞的培养皿抛却培养液后放到物镜下，在如图1所示的系统中，宽带光源经过光纤耦合器耦合到准直镜，经物镜照射到样品表面，同时细胞的后向散射光被准直镜接收，再经光纤耦合器耦合到光谱仪上，获得细胞的后向散射光谱。光谱仪接收到的光谱数据传输到电脑进行处理分析。FCBS光谱仪带有一个观察部分，用来确保检测的是单个细胞^[8]。

3 实验结果 3.1 光谱分析

图3为光谱仪所采集到的三种细胞的平均后向散射光谱数据，分别为正常肝细胞株（L02）、低转移潜能肝细胞株（MHCC97-L）和高转移潜能肝细胞株（HCCLM3）。其中横坐标为波长；纵坐标是相对后向散射光强度S，即相对于硅片的后向散射光谱。实验测量了可见光到近红外波段，即450～1 000 nm波长。

由图3可见，三种细胞在整体曲线趋势上区别很明显。在500～800 nm波长范围，低转移潜能肝癌细胞株的散射光强明显高于另外两种细胞，可能是由于细胞癌变后体积变大，相对核仁较少，细胞内部结构分布的不均匀提高了散射系数，导致后向散射光强增大。正常肝细胞株和高转移潜能肝癌细胞株的光谱曲线趋势在500～900 nm波长范围有一定的相似性，但高转移肝癌细胞没有如正常肝细胞一样的周期性的变化，且散射光强要比正常肝细胞低，可能是高转移潜能肝癌细胞核仁增多，内部结构的不对称已经破坏了细胞质和细胞核边界所形成的峰，高核质比使细胞对照射光的吸收更强，散射光强变小。

3.2 PCA降维结果

从图3光谱曲线图上看，由于系统误差，可以看到光谱曲线在开始和结尾处有明显的噪声影响，因此选取500～950 nm波段的光谱进行PCA分析。对原始光谱数据进行平滑、标准化等预处理后进行主成分分析。从式（2）中协方差矩阵c找到一个正交矩阵p，满足p^Tcp=λ，得到特征值矩阵λ后降序排列，这个特征值矩阵就是主成分的贡献率。三种细胞共焦后向散射光谱的主成分贡献率如表1所示，由于前两个主成分的累积贡献率已经达到95.4%，所以前两个主成分已经可以表示原始光谱的主要信息。

图4表示三种肝细胞共69个样本的主成分1、2的得分图，其中正常肝细胞株19组，低转移潜能肝癌细胞株20组，高转移潜能肝癌细胞株30组。

从图4主成分1和主成分2的得分图可以观察到，三种细胞具有明显的区分。正常肝细胞株（L02）分布在PC1的−20与20之间，PC2的−10与30之间。低转移潜能肝癌细胞株（MHCC97-L）主要分布在PC1的正半轴和PC2的负半轴。高转移潜能肝癌细胞株（HCCLM3）主要分布在PC1的负半轴，PC2的−20与−10之间。

3.3 SVM的模型预测结果

对FCBS光谱仪获得的三种细胞后向散射光谱，随机选取其中的50组数据（正常肝细胞株15组，低转移潜能肝细胞株15组，高转移潜能肝细胞株20组）作为训练集，首先对数据进行归一化预处理，建立属性矩阵和标签，训练得到模型并对剩余的19例样本预测集进行预测，由于光谱数据的特征比较多，选用线性核。预测结果如表2所示。

对预测样本预测结果如图5所示，由表2及图5可见，样本序号8预测结果错误，其他预测结果准确，整体分类准确率为94.7%，具有较高的正确率。说明SVM可以进行细胞光谱的分类识别。

4 讨论与结论

肝癌转移复发的过程中会不断复制筛选出具有不同转移潜能的肝癌细胞，本文基于光纤共焦后向散射光谱系统，采集正常肝细胞株、低转移潜能肝癌细胞株和高转移潜能肝癌细胞株的后向散射显微光谱数据，分别采用PCA和SVM两种不同的算法对光谱数据进行了自动分类研究。

实验结果显示，PCA的前两个主成分的累积贡献率达到95.4%，因此前两个主成分已经包含了原始光谱数据的大部分信息。从图4中我们可以看到，三种细胞在主成分1和主成分2的得分图上的分布较为规律，三种细胞有明显的区分。支持向量机是以统计学习理论为基础的算法，对小样本情况具有非常好的分类效果。本研究中使用SVM对不同转移潜能的肝癌细胞训练分类模型并进行预测，准确率达到了94.7%。

实验证明FCBS光谱仪分别结合PCA和SVM可以对肝癌转移侵袭时不同转移潜能的细胞实现快速、准确的分类。为了进一步提高光谱识别和分类的精度，未来需要进一步增加样本量，建立不同细胞的标准光谱数据库，优化智能识别算法，为临床预测和抑制原发性肝细胞癌的转移侵袭提供有效的检测手段。