2020, Vol. 42
Issue (2): 1-7
2. 上海理工大学 上海市现代光学系统重点实验室，上海 200093
2. Shanghai Key Laboratory of Modern Optical System, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China
特布他林（terbutaline，TB）是一类结构和功能都类似肾上腺素的苯乙胺类衍生物，近年来，不法商贩将其添加于喂养动物的饲料中，以提高瘦肉率、改善料肉比，从中牟取暴利。但研究发现，动物源性食品中特布他林的残留可对人体产生极大伤害，食用含有瘦肉精的猪肉很容易引起中毒，重者出现心慌、肌肉震颤、头疼、神经过敏等症状，轻者无明显感觉，但长期食用可致“慢性中毒”，引起染色体畸变，诱发恶性肿瘤。因此欧盟、中国等国家禁止在畜禽生产上使用TB。
目前，TB检测主要采用的方法有高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、气相色谱-质谱联用法和酶联免疫法等。色谱法具有准确、灵敏的特点，但样品前处理过程繁琐，检测速度慢，不适于现场大量筛选。酶联免疫法作为一种快速筛选药物残留的方法，具有操作简便、样品容量大、仪器化程度高和分析成本低的特点，但是酶联免疫法的影响因素多，易出现大量假阳性结果。因此建立快速、简便、高效的检测TB的方法一直是食品安全研究领域的热点。
表面增强拉曼光谱（surface enhanced Raman spectroscopy, SERS）是纳米尺度上的特殊表面增强光学现象，由于其独特的指纹光谱特性、非破坏性的快速检测和高灵敏度，成为了一种实用的化学和生物分子传感与识别分析工具。SERS通常采用表面粗糙的纳米金属材料（如金、银等）作为基底，金属结构表面的局域等离激元可以有效地将吸附在基底表面的待分析物分子的拉曼散射信号增强104～1015倍。为进一步提高SERS检测灵敏度，研究人员开发了不同形貌的金属纳米结构的制备方法[1]，包括球形、三角形片及纳米棒等，但是纳米尺寸的金属颗粒的表面能较高，容易聚集，因此稳定性较差[2]。例如，Izquierdo-Lorenzo等就是使用金纳米颗粒作为基底对TB进行检测，但是金纳米粒子稳定性较差，因此其检测效果有待提高[3]。为了实现更高灵敏度的TB检测，开发基于AuNPs的纳米复合结构，改善金纳米粒子的性能是必要的。迄今为止，各种材料，包括金属有机框架（MOFS）[4-5]、硅纳米线（SiNws）、Pbs、Ag、Pd、SiO2和Fe3O4已被用于构建功能性AuNPs基纳米复合材料。其中，Fe3O4磁性纳米颗粒与贵金属（Au，Ag）的结合将更利于增强SERS强度，这是因为磁聚集会引起光学热点，热点内的电磁耦合作用会导致电磁场强度增强。例如：Cai等已制备的Fe3O4/C/Au-to-SERS，在外磁场作用下，可以产生更多光学热点来催化反应[6]；Zhang等制备的Fe3O4/TiO2/AuNPs核壳微球具有出色的SERS活性[7]。另一方面，SiO2具有良好的亲水性、生物相容性，同时表面易于进行功能化，可以用来提高AuNPs在盐溶液中的稳定性[8-10]。同时SiO2作为Fe3O4纳米粒子包裹层，可以保护Fe3O4，增强Fe3O4纳米粒子在复杂环境中的稳定性，还为后续的功能化提供更多可能。因此，本文采用Fe3O4/SiO2/Au-MNPs核壳微球对TB进行了无标痕量检测。
本文以磁性纳米球为核，并包覆上SiO2薄层，然后通过静电作用在SiO2表面均匀密集地吸附金纳米粒子，最终得到同时具有磁性和SERS活性的卫星状的纳米核壳结构。该结构具有更好的电磁耦合作用，可以在金纳米粒子之间形成大量热点，从而使表面获得更好的SERS增强作用。
1 实验部分 1.1 结构设计本研究采用Fe3O4/SiO2/Au-MNPs核壳结构对TB进行检测。图1为探针制备流程图，图2为TB检测流程图。
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图 1 探针制备流程图 Figure 1 Flow chart of nanosensors preparation |
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图 2 Terbutaline检测流程图 Figure 2 Flow chart of Terbutaline detection |
首先，以粒径为150 nm的Fe3O4磁性纳米颗粒（Fe3O4 MNPs）为内核，在乙醇介质中用氨催化水解四乙氧基硅烷（TEOS），从而在Fe3O4表面包裹一层薄薄的SiO2层，形成Fe3O4/SiO2磁性纳米粒子（MNPs）；然后，利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），对Fe3O4/SiO2磁性纳米粒子（MNPs）表面进行氨基化修饰，使其表面带正电；最后，带负电的粒径为15 nm的金纳米粒子（AuNPs）通过与－NH2之间的静电相互作用组装到Fe3O4/SiO2的表面，形成卫星状核壳结构的Fe3O4/SiO2/Au-MNPs。此过程有效地解决了Fe3O4与贵金属之间不相容、成键难的问题，使金纳米颗粒的包覆更为容易。得到的磁性SERS纳米基底用于检测TB，TB通过氨基与金纳米粒子之间的作用结合到Fe3O4/SiO2/Au-MNPs表面，在外加磁场作用下，结合有TB的Fe3O4/SiO2/Au-MNPs发生聚集，溶液中的TB被磁性分离和富集出来，然后使用拉曼光谱仪检测基底表面TB的SERS信号。
1.2 材料与仪器柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O，99%）、三水合氯金酸（HAuCl4·3H2O，99%）、纳米四氧化三铁（99.5%）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，99%）、硅酸四乙酯（TEOS，98%）、氨水（NH3·H2O）、无水乙醇（C2H6O）均购于麦克林，特布他林半硫酸盐（C12H19NO3·1/2H2SO4，阿拉丁）、实验使用去离子水（18.25 MΩ·cm）通过亿利实验室超纯水机（YL-100，深圳市亿利源水处理设备有限公司，中国）制备，SHA-B数显恒温水浴振荡器（天津赛得利斯实验分析仪器制造厂）、pH-103笔式酸度计（pH-103，常州爱德克斯仪器仪表有限公司，上海）。
1.3 AuNPs的制备金纳米粒子通过柠檬酸钠还原三水合氯金酸的制备方法得到[11]，即利用柠檬酸钠作为还原剂制备金纳米粒子。首先在250 mL烧杯中加入100 mL去离子水并匀速搅拌；然后加入370 μL质量分数为10%的氯金酸溶液持续搅拌，将其加热至沸腾后，继续加入10 mL 38.8 mmol/L的二水合柠檬酸钠溶液，溶液逐渐变成酒红色，保持沸腾30 min；最后冷却至室温，隔夜备用。
1.4 Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的制备将1 mg Fe3O4 MNPs溶于5 mL无水乙醇中，超声分散后，再加入0.3 mL的氨水和30 μL的TEOS溶液并继续超声5 min，待溶液均匀分散后，将混合液放入恒温水浴震荡器中震荡18 h（转速为200 r/min）。震荡完成后，利用磁性将纳米粒子分离出来，并用乙醇清洗及重新分散至5 mL。随后加入540 μL APTES溶液继续震荡8 h（转速为200 r/min），合成出均一的、单分散并带有氨基修饰的Fe3O4/SiO2－NH2纳米颗粒。震荡完成后，用磁性分离的方法将磁性纳米粒子吸出，并用乙醇清洗，然后加入6 mL已制备的金种子，并继续震荡21 h（转速为200 r/min）。震荡完成后，用磁性将纳米粒子分离出来，并用乙醇清洗及分散至6 mL。
1.5 Fe3O4/SiO2/Au/TB-MNPs的制备将TB稀释成1×10−4 mol/L、1×10−5 mol/L、1×10−6 mol/L、1×10−7 mol/L、1×10−8 mol/L的溶液。分别取100 μL已制成的Fe3O4/SiO2/Au-MNPs溶液分别加入100 μL不同浓度（1×10−4 mol/L、1×10−5 mol/L、1×10−6 mol/L、1×10−7 mol/L、1×10−8 mol/L）的TB中，配成终浓度分别为5×10−5 mol/L、5×10−6 mol/L、5×10−7 mol/L、5×10−8 mol/L、5×10−9 mol/L的溶液。随后放入恒温水浴震荡器中震荡21 h（转速为200 r/min）。震荡完成后，用磁性分离的方法分别将这些溶液中的纳米粒子吸出，然后用去离子水稀释至60 μL。由文献[3]可知，在酸性环境下对TB检测效果较好，故将稀释出溶液的pH调为5.5。
1.6 SERS检测首先，取浓度5×10−5 mol/L、5×10−6 mol/L、5×10−7 mol/L、5×10−8 mol/L、5×10−9 mol/L的待测液各5 μL，并分别滴加在玻片上晾干；然后，使用共聚焦拉曼光谱仪（XploRA Plus，HORIBA Scientific）对样本进行拉曼测试。检测时，激光光源功率为10 mW、波长为638 nm，显微物镜的放大率为10倍，图像拍摄的曝光时间为4 s，曝光次数为2次，狭缝宽度30 μm，光谱采集范围为300~1 800 cm−1。用UV-3600分光光度计检测AuNPs和Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的消光光谱。采用透射电镜（JEM-2100F，JEOL电子显微，200 kV）对Au、Fe3O4、Fe3O4/SiO2和Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的形貌进行表征。
2 结果与讨论 2.1 Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的表征Fe3O4/SiO2/Au-MNPs由Fe3O4磁芯、SiO2壳层和AuNPs吸附层组成。SiO2壳层作为中间层将磁核和AuNPs组装起来，AuNPs分布在SiO2壳层表面，得到核壳性的纳米微型结构，同时具有优异的超顺磁以及SERS光学活性。利用透射电镜（TEM）对纳米颗粒的大小和形貌进行了表征，结果如图3所示。图3（a）为使用经典柠檬酸钠还原法合成的AuNPs，其平均大小为13 nm。图3（b）为呈球形的Fe3O4磁核，分散较好，粒径大约为150 nm，且在Fe3O4磁核表面包裹一层SiO2。图3（c）为呈球状的Fe3O4/SiO2纳米粒子，且SiO2与Fe3O4中有很明显分界，表明SiO2已成功地包覆在Fe3O4纳米粒子的表面。由于柠檬酸钠还原的金纳米粒子表面带负电，通过静电吸附作用，金纳米粒子可以吸附到Fe3O4/SiO2表面，最终形成纳米卫星状的Fe3O4/SiO2 MNPs，如图3（d）所示，Fe3O4/SiO2 MNPs的周围均匀地附着了大量的AuNPs。
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图 3 Au，Fe3O4 MNPs，Fe3O4/SiO2和Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的TEM图 Figure 3 TEM Images of Au, Fe3O4 MNPs, Fe3O4/SiO2 and Fe3O4/SiO2/Au-MNPs |
AuNPs和Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的消光光谱如图4所示，AuNPs在520 nm波长处有明显的吸收峰，这是由于AuNPs的表面等离子体共振吸收导致的[12]。当Fe3O4/SiO2表面吸附AuNPs后，在650 nm处可以观察到一个较宽的峰，与AuNPs相比，特征峰发生了明显的红移，这是由于金纳米粒子在Fe3O4/SiO2 MNPs表面发生了一定的聚集[13]，表明AuNPs已经成功装载到Fe3O4/SiO2的表面[14]。此外，通过改变APTES的用量（如分别采用180 μL、360 μL、540 μL）对Fe3O4/SiO2表面进行不同程度的氨基化修饰，从而改变Fe3O4/SiO2表面吸附的金属纳米粒子密度，对吸附的金纳米粒子进行进一步优化。由图4可知，使用540 μL APTES做出的Fe3O4/SiO2/Au-MNPs效果最佳（因为其消光谱强度最强），故后续实验都保持该用量。
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图 4 Au以及在APTES的不同用量下制备的Fe3O4/SiO2/Au-MNPs探针的消光光谱 Figure 4 Extinction spectra of Au and Fe3O4/SiO2/Au-MNPs at different quantities of APTES |
完成基底的制备和表征后，我们利用该基底对TB进行定量检测。分别对5×10−5 ～5×10−9 mol/L浓度梯度下的TB进行SERS检测。在每个浓度下，随机选取15个点进行检测，平均光谱即为该浓度下TB的拉曼信号，如图5所示。光谱图上的特征峰峰位与 Ali等检测的TB峰位相一致[15]，如表1所示，具体体现在1 600 cm−1是C＝C的拉伸带，1 034 cm−1是C－OH的呼吸带，780 cm−1是C－H的摇摆振动带，400 cm−1是CCC的变形带。这些特征峰表明本实验的检测物为TB。同时，图5显示了不同浓度下TB的SERS光谱图。可以看出，随着TB浓度的降低，其特征峰值的强度也随之逐渐减小，且拉曼光谱特征保持着一定的完整性。
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表 1 特布他林的基础共振波数 Table 1 The fundamental vibrational wavenumbers of terbutaline |
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图 5 TB在不同浓度下(5×10−5 ～5×10−9 mol/L）的拉曼光谱图 Figure 5 The Raman spectra of TB at different concentrations (5×10−5 -5×10−9 mol/L). |
因此，以TB在1 034 cm−1处拉曼峰的信号强度为纵坐标、TB浓度的对数值为横坐标绘制其校准曲线，如图6所示（进行归一化处理），再利用最小二乘法计算出校准曲线，得到
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图 6 在1 034 cm−1处TB浓度对数与拉曼强度的线性关系图 Figure 6 Linear plot of intensity of the 1 034 cm−1 peak for various concentrations of TB |
| $ I_{\rm{1034}} = 671.6 + 71.1 {\rm{lg}} C $ | (1) |
曲线的R2=0.996。结果显示，在5×10−5 ～5×10−9 mol/L范围内TB的SERS信号强度相对于浓度梯度呈现出良好的线性关系。根据3-sigma规则计算最低检测限[16]（噪声取自850～950 cm−1波段），具体计算式如下：
| $ {\rm{LOD = 1}}{{\rm{0}}^{\frac{{\left[ {\frac{{\left( {{{Y_{\rm{b}} + 3\sigma }}} \right)}}{{{{Y_{\rm{b}}}}}}{{ - A}}} \right]}}{{{k}}}}} $ | (2) |
式中：Yb为噪声信号的平均值46.2；σ为噪声信号的标准差18.4；A为校准曲线的截距；k为校准曲线的斜率。利用式（2）计算出LOD为3.77×10−10 mol，表2为特布他林曲线拟合结果。
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表 2 特布他林线性拟合结果 Table 2 Linear fitting results of terbutaline |
本文提出一种利用磁性SERS基底快速富集和检测TB的方法。该基底以磁性纳米球为核，在表面附着上SiO2薄层，并将金纳米粒子密集地组装在SiO2表面上，最终形成一种纳米卫星状的核壳结构。由于最外层组装的金纳米粒子比较密集，相邻粒子之间有强烈的电磁耦合作用，在金纳米粒子之间形成大量热点，因此该基底具有优异的SERS活性。同时该基底还集成了优异的磁性分离功能，可对待测分子进行快速富集，进一步增强待测分子的SERS信号。该方法具有前处理简单、检测灵敏度高、检测速度快等优点。本文多层组装纳米复合结构的合成方法也为其他多功能复合材料的制备提供了参考。
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