2020, Vol. 42
Issue (1): 76-81
2. 大阪大学 先进光子研究中心，大阪 565-0871
2. Photonics Advanced Research Center, Osaka University, Osaka 565-0871, Japan
毛细管电泳是以毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力的液相分离技术[1-2]。由于毛细管容易散热，因而可以承受更高电压[3]。此外，该技术试剂消耗量极少，分辨率高，重复性好而且自动化程度较高，因此被广泛应用于分子生物学、基因科学、生命科学等领域[4-7]。
目前，国内外普遍使用的单通道毛细管电泳仪主要是SCIEX公司、Sebia公司与Agilent公司等国外公司的产品[8]。例如：Kovacs等使用SCIEX P/ACE MDQ系统对多发性骨髓瘤中的血清异常蛋白进行糖基化毛细管电泳分析[9]；王游声等使用Sebia Capillarys全自动毛细管电泳仪开展了地中海贫血筛查的研究[10]；Hawrylaknowak等使用Agilent 7000分析了植物叶和根匀浆中的有机酸浓度[11]。然而当前的毛细管电泳仪价格较高，限制了该技术在中小型实验室的进一步推广。目前的毛细管电泳仪多采用光学吸光度法[12]和荧光检测法，相对于荧光检测方法，光学吸光度法灵敏度较低。在已有研究工作的基础上[13-15]，本文构建了一种基于荧光显微镜的毛细管电泳系统。相对于商业毛细管电泳仪，该系统灵活性较高，不仅保留了荧光显微镜原有的功能，而且可以实现DNA的高效分离。
1 毛细管电泳系统的构建所构建毛细管电泳系统如图1所示，该系统主要由BX51荧光显微镜、U-MWIB-3滤光片、U-RFL-T汞灯光源（奥林巴斯，日本）、石英毛细管（Polymicro Technologies，美国）、MODEL 610E高压电源（Trek，美国）、H8429-101光电倍增管（滨松，日本）与计算机等组成。在毛细管上高温烧制一2.0 mm的透明窗口作为检测窗口，并将其固定在检测平台上。
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图 1 基于荧光显微镜的毛细管电泳系统 Figure 1 The capillary electrophoresis system based on a fluorescence microscope |
在毛细管两端施加高压直流电压，使带有负电荷的DNA由负极向正极泳动。荧光染料与DNA结合会产生荧光基团[16]，当荧光基团通过检测窗口时，荧光基团受入射光激发产生相应波长的荧光。根据这一特性，本文采用汞灯作为系统光源，光源发出的光经带通滤光片B1过滤后，产生460～495 nm的入射光。分色镜H1涂有不同折射率的光学涂层，通过控制层的厚度和数量，可将不被需要的波长透射，其余波长反射。入射光经过分色镜H1反射并通过物镜O1，激发毛细管里透明窗口位置的荧光基团，产生中心波长为516 nm的发射光，该荧光发射光经物镜和分色镜H1，再经滤光片B2滤除杂散光，通过PMT使荧光信号增强，之后由整流器将光信号转换为电信号，最后在计算机上显示电泳图谱。
2 实验部分 2.1 实验试剂配制实验所用化学试剂：φX174-Hinc Ⅱ digest（50 ng/μL），100 bp DNA ladder（130 ng/μL），20 bp DNA ladder（100 ng/μL）（Takara，日本），10 000× SYBR Green I（Invitrogen，美国），相对分子量为1 300 K的羟乙基纤维素（hydroxyethyl cellulose，HEC）（Polysciences，美国），过硫酸铵（ammonium persulfate，APS），四甲基乙二胺（N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine，TEMED），10× Tris硼酸（Tris-borate-EDTA，TBE），丙烯酰胺（acrylamide，AM）（索莱宝，北京），3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（3-methacryloxy propyl trimethoxy silane）（Shin-Etsu Chemical，日本），乙酸（麦克林生化科技，上海），甲醇（光华科技，汕头），超纯水。
实验试剂配置如下：取25 mL 10× TBE加入超纯水定容至500 mL，制成0.5× TBE 室温保存；取1 μL 10 000× SYBR Green I 加入99 μL超纯水，制成100× SYBR Green I，4 ℃低温避光保存；分别称取0.05 g和0.1 g HEC，加入0.5× TBE定容至10 mL，制成质量分数为0.5%和1%的HEC筛分介质溶液，搅拌48 h，室温保存；取1 μL φX174-Hinc Ⅱ digest加入9 μL 0.5× TBE，制成 5 ng/μL φX174-Hinc Ⅱ digest样品，4 ℃低温保存。
2.2 毛细管预处理毛细管内壁与DNA分子之间存在吸附作用，为毛细管内壁涂层添加稳定的膜层结构，可以有效抑制样品吸附，提高分离效率，控制电渗。本文采用硅烷化法对毛细管内壁进行预处理（预涂层）[15]，其步骤如下：（1）分别用1 mol/L NaOH、超纯水、甲醇各冲洗15 min；（2）取100 μL甲醇，8 μL 3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，1 μL乙酸，1891 μL超纯水置于离心管中，配成2 mL混合溶液，将溶液吸入毛细管，常温静置2 h即可将硅烷共价键膜层镀于毛细管内壁；（3）在无氧条件下，将0.7 g AM、20 mg APS和20 μL TEMED溶解于20 mL超纯水中制成混合溶液，用该溶液冲洗经过硅烷化涂层的毛细管2 h；（4）超纯水冲洗15 min，保存备用。
3 结果与分析 3.1 系统稳定性验证为验证系统的稳定性，在构建的毛细管电泳系统中对6.5 ng/μL的100 bp DNA ladder样品进行相同电泳条件的多次毛细管电泳实验，分别统计各个DNA条带的峰值及其出现时间，并做误差分析。其中100 bp DNA ladder样品包含100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1 000 bp、1 500 bp 11个DNA片段。将2 μL 100× SYBR Green I 加入至198 μL 0.5% HEC中震荡混合均匀，作为筛分介质。电泳前，采用超纯水冲洗毛细管5 min。使用真空泵将筛分介质吸入总长8 cm，有效长度6 cm、内径75 μm的经过预处理的毛细管。电泳进样电压800 V，进样时间1 s，电场强度100 V/cm。电泳结束后，再次采用超纯水将毛细管冲洗5 min，电泳结果如图2所示。
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图 2 100 bp DNA ladder毛细管电泳 Figure 2 Capillary electrophoresis of 100 bp DNA ladder |
相同条件下的5次100 bp DNA分离结果如图2（a）所示，可以发现，11个DNA片段在8 min内被有效分离出，且相邻DNA片段对应电泳峰区分比较明显。对比不同批次的DNA分离结果，可以发现，500 bp DNA片段的电泳峰对应迁移时间出现了明显漂移，这主要是由电泳时放置毛细管的平台不够牢固、检测窗口左右轻微移动所致。在5次实验中，每一个片段电泳峰值出现的时间及荧光强度的具体结果如图2（b）和（c）所示，其中：1 500 bp片段的峰值出现时间误差值最大，为1.56%；500 bp片段的电泳峰值误差值最大，为4.07%。该结果表明，电泳峰出现时间及其荧光强度基本稳定。
3.2 灵敏度测试以不同质量浓度的100 bp DNA ladder为样品，对毛细管电泳系统的灵敏度，即检测极限做了研究。将130 ng/μL 100 bp DNA ladder分别稀释20倍、100倍、110倍，电场强度100 V/cm下分离结果如图3所示（图中标记了长度为1 000 bp 的DNA片段峰形位置）。结果表明：1 500 bp以内DNA可在8 min内实现有效分离，且随着DNA质量浓度的降低，其荧光信号也逐渐减弱；当DNA样品质量浓度为1.3 ng/μL时，900～1 500 bp对应DNA片段基本可以分离；当DNA进一步稀释至1.18 ng/μL时，高于900 bp的DNA片段无法清晰辨别。由于500 bp DNA质量浓度约为其他长度DNA质量浓度的3倍，其他长度DNA片段质量浓度基本相同。为此，可以确定该系统检测极限为0.1 ng/μL。
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图 3 不同质量浓度100 bp DNA ladder毛细管电泳 Figure 3 Capillary electrophoresis of 100 bp DNA ladder with different concentrations |
分别对20 bp DNA ladder（10 ng/μL）、φX174-Hinc Ⅱ digest（5 ng/μL）进行了毛细管电泳分析。其中，分离φX174-Hinc Ⅱ digest电泳条件同3.1节。分离20 bp DNA ladder的电泳条件如下：筛分介质1% HEC，进样电压800 V，进样1 s，电场强度100 V/cm，毛细管有效长度6 cm，总长8 cm。φX174-Hinc Ⅱ digest DNA包括13条片段：79 bp、162 bp、210 bp、291 bp、297 bp、335 bp、341 bp、345 bp、392 bp、495 bp、612 bp、770 bp、1 057 bp。结果如图4（a）显示，对于335 bp、341 bp、345 bp DNA片段，由于其长度比较接近，在电泳图谱中呈一个峰显示。20 bp DNA ladder中60 bp、80 bp、100 bp、120 bp、140 bp、160 bp、180 bp、200 bp、300 bp、400 bp与 500 bp 可以有效被分离出，如图4（b）所示。20 bp与40 bp DNA电泳峰出现重叠，若要使这两个DNA条带有效分离，可以通过提高HEC浓度、延长毛细管有效长度或降低电场强度实现。
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图 4 不同DNA ladder毛细管电泳图 Figure 4 The electropherogram of different DNA ladders |
在相同电泳条件下分别对130 ng/μL和1.3 ng/μL 100 bp DNA ladder样品做分离检测，如图5所示。商用毛细管电泳仪（P/ACE MDQ PLUS，上海爱博才思分析仪器贸易有限公司）可通过检测吸光度进行样品分析，由于DNA结构上具有紫外光吸收的特性，其最大吸收峰在260 nm处，因此选用P/ACE MDQ PLUS自带的254 nm的滤光片。电泳条件为：进样电压3 kV，进样时间5 s，以0.5% HEC作为筛分介质，电场强度100 V/cm，毛细管总长度30 cm，有效长度20 cm。检测结果显示：当采用未经处理的毛细管时，几乎检测不到有效的DNA电泳图谱；当采用0.1 mol/L NaOH对毛细管冲洗5 min，再用超纯水冲洗5 min后[17]，可以有效完成130 ng/μL 100 bp DNA ladder的分离，而由于1.3 ng/μL DNA ladder质量浓度太低，几乎检测不到DNA信号，如图5（a）所示。在构建的毛细管电泳系统上，由于130 ng/μL 100 bp DNA ladder质量浓度过高，电泳峰几乎叠加在一起，而1.3 ng/μL的100 bp DNA ladder可以被有效分离出，如图5（b）所示。由此可知，采用荧光法检测DNA可以提高毛细管电泳系统的检测极限。此外，商用毛细管电泳仪由于毛细管检测窗口位置已固定，有效毛细管长度至少要20 cm，而自建的毛细管电泳系统可以根据自己需要来任意设定毛细管长度，从而节约了检测时间。
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图 5 毛细管电泳分离100 bp DNA ladder结果对比 Figure 5 The contrast of capillary electrophoresis of 100 bp DNA ladder |
本文构建了一个基于荧光显微镜的毛细管电泳系统，并以DNA ladder为样品，对系统的稳定性、灵敏度以及分离效果做了全面分析。结果表明：对于相同的DNA样品，相同电泳条件下同一长度DNA片段对应电泳峰时间基本相同；所建系统灵敏度可以达到0.1 ng/μL；在优化的电泳条件下，可分离相差6 bp的DNA片段；相对于商用毛细管电泳仪的吸光度检测法，自建系统不仅成本较低，而且可以有效提高其检测极限。本文构建的毛细管电泳系统易于搭建，灵活性强，可为毛细管电泳技术的更好发展提供参考。
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