引言

数字切片扫描仪是一种集光学、机械、电子、计算机等多学科技术为一体的精密仪器, 通过控制显微成像系统和切片以一定的规则运动, 采集多张连续的高分辨率显微图像, 再无缝拼接生成一张高分辨率的全切片图像(WSI, 也称为虚拟切片)。传统切片变成一张高分辨率的数字图片后, 用户可以脱离显微镜随时随地在计算机或移动设备上浏览切片, 这种数字图片具有永不褪色, 易于保存、管理、分享以及可随意放大缩小全方位观看等优点^[1-2], 已经广泛应用于病理诊断、教学培训、药物研究和科学研究等领域。随着应用的拓展, 促使切片扫描仪技术的不断进步, 出现了多种扫描技术, 显著提高了扫描速度, 完成扫描时间已从最早的几十分钟缩短到现有的几十秒。这些技术包括走停模式的面阵扫描、连续运动的线阵扫描、连续运动的面阵扫描、连续运动的微物镜阵列扫描, 主要区别在于所用的图像传感器和切片运动方式两方面, 图像传感器主要有面阵和线阵两种, 切片运动方式主要有走停和连续运动两种。

1 走停模式的面阵扫描

基于走停模式面阵扫描的数字切片扫描仪主要由电动载物台、显微成像系统和面阵图像传感器组成。工作时首先将切片沿着其Y方向划分成若干个连续的等间距扫描条带, 每个扫描条带的宽度为显微成像系统的物方视场在Y方向的尺寸, 相邻条带间留有一定的重叠部分, 同时将每个扫描条带沿着X方向再划分成若干个连续的扫描视场, 每个扫描视场的长度为成像系统的物方视场在X方向的尺寸, 相邻扫描视场间留有一定的重叠部分, 如图 1所示; 然后控制载物台带动切片从第一条扫描条带的第一个扫描视场开始, 以扫描视场为单位进行走走停停的步进, 依次穿过显微成像系统, 载物台每次停止后, 面阵图像传感器开始对焦并曝光采集图像, 直到当前条带的所有扫描视场采集完成; 再后根据相邻视场的重叠区域拼接成一个条带, 并沿Y方向移动至下一个扫描条带扫描, 依此类推, 采集完所有条带的图像; 最后根据相邻条带的重叠区域进行无缝拼接, 生成一张完整的数字切片图。

最早的产品是Bacus实验室(后被奥林巴斯收购)于1994年研发的BLISS系统, 该系统是在显微镜上改进而成的。该系统的实现方法较为简单, 但采集过程中要求载物台走走停停, 而且停止后还需再等待一段时间, 确保载物台稳定后再开始对焦和曝光, 因而速度非常慢。其中对焦过程比较费时间, 需要在Z方向采集多张图像以计算出离焦量, 然后再驱动至焦面。通常一个视场对焦一般需要若干秒时间, 15 mm×15 mm的扫描范围一般需要1 000个视场, 再加上载物台移动及等待时间, 图像采集及拼接时间, 需要几十分钟^[3]。此扫描速度比较慢, 主要问题在于对焦方法上, 后续出现了两种改进方案:一是采用焦面建模的方法, 即先选取切片的若干视场并以计算出的焦面位置作为模型点, 根据这几个模型点再通过算法估算出切片中每个视场的焦面位置, 这样在扫描时, 只需根据建模的焦面位置直接对焦即可, 如DigiPath的PathScope在20×模式时, 15 mm×15 mm的扫描范围可以缩短到150 s左右, 由于此方法大部分视场的焦面是由建模估算而得, 不能确保每个扫描视场是完全清晰的; 二是采用专用的自动对焦装置, 每个扫描视场的对焦时间缩短到几十毫秒左右^[4], 麦克奥迪实业集团有限公司的最新产品EasyScan就集成了专用自动对焦装置^[5], 能有效提高扫描速度, 在40×分辨率时, 最快可以达到160 s(扫描范围15 mm×15 mm), 同时能确保每个扫描视场准确对焦。

2 连续运动的线阵扫描(简称线扫)

该方案借用了遥感领域和工业检测领域中成熟的线阵图像传感器扫描技术, 主要由电动载物台、显微成像系统和线阵图像传感器组成。工作时首先将切片沿着其Y方向划分成若干个连续的等间距扫描条带, 每个扫描条带的宽度为显微成像系统的物方视场在Y方向的尺寸, 相邻条带间留有一定的重叠部分, 如图 2所示; 然后根据上述提到的焦面建模方法计算出切片的焦面模型, 控制载物台带动切片从第一条扫描条带开始, 以一定的速度匀速运动, 同时控制线阵图像传感器按一定时序同步曝光, 实现对当前条带的图像采集, 直到当前条带采集完成, 再移动至下一个扫描条带扫描成像, 依此类推, 采集完所有条带的图像; 最后根据相邻条带的重叠区域进行无缝拼接成一张数字切片。

该方法在对每个条带进行扫描成像时, 载物台带动切片是连续运动的, 不需要走走停停和等待, 也不需要拼接, 所以速度比较快。线扫的数字切片扫描仪最早是Aperio(2012年被Leica收购)于2000年推出的, 随后Leica、Hamamatsu、江丰等也相继推出。目前速度最快的是Hamamatsu的NanoZoomerXR, 在40×模式下扫描15 mm×15 mm范围只需45 s^[6]。该产品采用的是一种更为高级的线阵图像传感器即时间延迟积分(TDI)传感器, 其操作与线阵图像传感器类似, 不同之处在于TDI图像传感器拥有几十甚至上百条线阵。工作时, 每条线阵图像传感器分时对同一标本曝光, 然后再叠加, 图 3为4级TDI传感器的工作原理图, 经过4级叠加后, 图像信号大大增强, 因而等效的曝光时间可以更短, 切片可以以更高的速度同步运动, 也就是扫描速度更快。

采用线扫方式速度较快, 但其对载物台的控制要求较高, 线阵传感器的成本也比较高。另外, 由于采用建模方法对焦, 容易出现扫描模糊的问题。

3 连续运动的面阵扫描

此方法综合了上述两种技术的特点:其组成跟技术1一样, 采用的是面阵图像传感器, 工作时也需事先按照技术1的方法将切片在X和Y方向划分成若干个连续的扫描视场, 如图 4所示; 扫描方法则跟技术2一样, 具体为控制载物台带动切片在X方向上进行连续运动并穿过显微成像系统, 每移动一个扫描视场时, 面阵图像传感器同步高速曝光和采集图像, 直到当前条带的所有视场采集完成, 然后根据相邻扫描视场的重叠区域拼接成一个条带, 再移到下一条带扫描, 依此类推, 采集完所有条带的图像, 最后根据相邻条带的重叠区域拼接成一张数字切片^[7]。该方案主要是在技术1基础上改进软件, 使得面阵传感器的曝光时序与载物台移动速度匹配, 实现较为简单, 且由于没有技术1的走走停停, 扫描速度可以提高很多, 因而同时具有线扫速度快和成本较低的优点。典型的厂家有Motic、Zeiss、3D Histech等, 其中3D Histech最新一代的数字切片扫描仪Pannoramic FlashⅢ在40×模式下, 扫描15 mm×15 mm的范围可以达到60 s以内^[8], 与线扫技术的速度相当。

4 微物镜阵列扫描

一般数字切片扫描使用的标准物镜20×/0.75, 其物方视场一般为1.1 mm左右, 考虑到平场性, 实际视场一般最多也只用到1 mm。所以扫描15 mm×15 mm时, 至少要扫描15个条带, 这在一定程度上限制了扫描速度。该技术采用一种微物镜阵列和定制的图像传感器来提高扫描视场, 以减少扫描条带, 从而提高扫描速度。所采用的微物镜阵列共有80个微物镜组成, 每个微物镜的视场是250 μm, 按照一定的规律排列, 确保每个微物镜的视场在扫描方向上的投影构成一条连续的线段, 通过图像处理可合并成一个线视场为20 mm线阵扫描系统^[9], 如图 5所示。这样扫描15 mm×15 mm只需扫描一个条带即可, 速度非常快。此技术由美国DMetrix公司于2004年推出, 18 mm×50 mm的范围只需158 s就可以扫描完成, 此扫描速度在当时是非常快的。

该技术需要先拼接成一个大视场的线阵成像系统, 且由于扫描视场大, 其对焦方式也非常有挑战性, 比线扫技术更为复杂。另外关键器件如微透镜阵列和图像传感器都是定制的, 成本高, 通用性不强。

5 结论

从上述的几种数字切片扫描技术原理及其特点来看:微物镜阵列扫描具有速度快, 但实现复杂, 成本高; 线扫可以实现较快的速度, 但随着连续运动的面阵扫描技术的发展, 其速度优势也不明显, 且对控制要求也较高, 也容易出现扫描模糊问题; 基于面阵传感器扫描实现较为简单, 可工作于连续运动和走停两种模式, 连续扫描运动模式可以提供与线扫接近的扫描速度, 走停模式可以提高扫描成功率并获得更好的图像质量。