2017, Vol. 39
Issue (2): 70-76
2. 福州大学 电气工程与自动化学院, 福建 福州 350116;
3. 福建省医疗器械和医药技术重点实验室, 福建 福州 350116
2. College of Electrical Engineering and Automation, Fuzhou University, Fuzhou 350116, China;
3. Key Lab of Medical Instrumentation & Pharmaceutical Technology of Fujian Province, Fuzhou 350116, China
生物芯片检测装置作为生物芯片上的微点阵信息的采集仪器, 在许多方面得到广泛的应用, 例如:DNA序列测序、基因表达检测和分子扩增等, 它的发展会带动医学中病原体的研究、生物细胞发育调控、药物研发及遗传筛选和诊断等领域的发展[1-3]。目前主流的检测方式有两种:一种是采用光电倍增管的激光共聚焦的方式, 另一种是高压氙气灯或汞灯结合CCD的成像方式。激光共聚焦方式是将激光聚焦到几微米并在芯片上来回扫描, 激发单个像素区域, 随后通过光电倍增管转换成数字信号; CCD成像方式则是, 先将光源过滤成窄带波长范围, 然后将光照射到芯片的大面积区域并使荧光标记物受激产生荧光, 再经CCD相机曝光收集[4]。由于前者的检测结构复杂且检测速度相对较慢, 后者的检测精度相对不高, 因此本文提出一种新的装置, 即采用二维高速振镜以控制激光光路, 提高扫描速度, 并使用冷却型CCD对信号进行采集, 简化整个检测装置的结构。由于激光共焦光路是对单个像素进行垂直激发, 因此它对每个像素的光照强度是一样的, 不存在光强校正的问题, 然而新设计的检测装置的激光光束是通过高速振镜倾斜投射于生物芯片表面, 激发光强随着倾斜角度的变化而变化, 无法保证芯片表面区域的激发光强均匀一致, 为此需对冷却型CCD相机所获得的检测图片进行检测数学模型的修正, 以解决激光斜照射而造成的光照不均匀的影响, 实现对生物芯片的检测。
1 硬件结构 1.1 硬件整体结构本文设计的生物芯片检测装置的结构简图如图 1所示。
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图 1 检测装置的结构简图 Figure 1 The structure of the detection device |
固定于光源支架上的红色激光光源经过光束准直扩束后发射出固定波长的平行光, 平行光经过圆形小孔整形为小圆斑并将光斑水平照射进二维高速振镜系统, 如图 1(b)所示, 二维高速振镜工作原理如图 2所示。振镜系统z轴方向安装的为X振镜, 平行激光经过X振镜A镜面的旋转可以实现x方向的扫描; 振镜系统x轴方向安装的为Y振镜, 平行激光经过Y振镜B镜面的旋转可以实现y方向的扫描。二维振镜可以将水平投射到A镜面的平行光线反射到B镜面后再次反射出射, 通过控制X振镜和Y振镜的旋转, 可以实现平行激光光束对xOy平面的生物芯片表面的二维扫描, 从而使芯片上的荧光染料被逐点激发, 使得荧光染料受激发出特定波长范围的荧光信号[5]。生物芯片检测装置通过荧光发射滤光片和冷却型CCD相机对该荧光信号进行采集和成像。
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图 2 二维高速振镜工作原理示意图 Figure 2 The operational principle of the two-dimensional high speed vibrating mirrors |
振镜是类似检流计的一种比较小的磁电式的偏转器件。通过交变的电流产生变化的磁场, 从而使得反射镜上的转子偏转, 控制振镜的偏转角度就可以使得激光能够扫描[6]。
在振镜转子带动反射镜偏转的过程中, 激光的偏转角度θx和θy与反射镜的偏转角度即转子的偏转角度αx和αy之间的关系为[7]θx=2αx和θy=2αy。
本文使用的DQ30二维高速振镜具有精度高、结构简单、安装便捷的优点, 而且它还支持差分信号和单端信号的输入, 拥有真实的每秒3万个脉冲的扫描速度。该振镜是通过电压来控制镜面偏转, 它的位置输出比例系数k为0.5 V/(°), 即每输入0.5 V的电压振镜就偏转1°, 该高速振镜的模拟位置输入范围为:±5 V。
2 激光扫描控制二维高速振镜是通过直流电压来控制它的偏转角度, 因此在振镜的控制方面选用意法半导体公司基于CoreTex-M3内核的微控制器STM32F103ZE。该处理器不仅体积小、功耗低而且性能高, 具有丰富的片内资源[8]。
2.1 STM32硬件电路设计STM32F103ZE处理器具有两个独立的DAC转换器, 刚好和二维高速振镜的X振镜与Y振镜相匹配。数字输入经过DAC模块后被线性地转换为模拟电压的输出, 通过合理地选用参考电压值可以输出预期的模拟电压值。但是, STM32的DAC模块只能够输出正向电压从0 V到参考电压VREF+, 而二维高速振镜的正常工作电压为-5~+5 V, 因此以3.3 V为VREF+, 设计一个放大减法的驱动电路使得STM32的DAC模块可以间接控制二维振镜所需要的-5~+5 V的模拟电压, 其硬件电路原理图如图 3所示。
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图 3 放大减法驱动电路 Figure 3 The subtraction and amplification driver circuit |
放大减法驱动电路采用两片OP07驱动芯片, 其中一片实现对STM32数字/模拟转换输出的放大功能, 另外一片则实现减法功能使得电路的输出具有负值电压[9]。
2.2 二维高速振镜控制设计采用弓字形的扫描方式对荧光微点阵36 mm×36 mm的矩形区域进行扫描, 即在y方向进行连续扫描, y方向每扫描一行后, 对x轴方向进行一个步进, 实现逐行的二维扫描。由于在对xOy平面二维扫描的全过程中, 冷却型相机的快门一直完全打开, 不断地曝光收集每个像素位置的荧光信号, 为提高扫描速度, 在y方向扫描的回程过程中, 同时也进行了另一行y方向的扫描, 整个扫描轨迹类似弓字形。同时, 因冷却型CCD相机快门打开, 采用弓字形逐行扫描时也不需要在y方向的回程过程中对激发光源进行截止, 从而降低了扫描装置的复杂性。
振镜在y方向的扫描剖面图如图 4所示。
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图 4 振镜对y方向的连续扫描示意图 Figure 4 The schematic of continuous scanning in y direction |
振镜的B镜片在y方向上扫描的偏转角度为行程y1到y2之间的角度, 通过计算可以得到αy(以O为0°的偏转角度为-4.5°~3.5°。同理可以得出, 在x轴方向上A镜片的偏转角度αx为-5.5°~5.5°。
根据上述振镜镜片偏转角度的限制条件, 为了产生实现“弓”字扫描的特殊电压信号波形, 设计了如图 5所示的波形产生流程图。
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图 5 波形产生流程图 Figure 5 The flow chart of waveform |
通过STM32F103ZE配置双DAC的模式并且使能双DAC通道, 根据对DAC_DHR寄存器的操作, 经过相应的位移使得写入的数据被转存到DHR寄存器中, 随后这些数据内容便会被自动地传送到DOR寄存器中, 接着通过相应的GPIO引脚就会得到特定的模拟输出电压。将STM32的其中一路数字/模拟转换输出的电压再经过放大减法驱动电路, 从而得到需要的三角电压波形, 另外一路则直接模拟输出送到振镜的驱动电路中, 最终实现二维高速振镜的“弓”字扫描。
3 检测数学模型由图 4所示的硬件结构及其扫描方式可知, 生物芯片的表面与激光光束的投射方向不垂直, 因此在生物芯片平面上各个位置的投射距离和投射角度均不同, 导致激光光束投射的面积与强度不一致。假设激光光束的入射强度为I, 截面为s×s, 激光光束经过A、B镜偏转投射到荧光微点阵表面上时, 其投影面积变成
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(1) |
从图 4可以看到, B镜偏转θy角度, 可以实现激光光束沿y方向从y1扫描至y2一行, 其中φ=45°+θy。
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(2) |
式中L为振镜B镜面到生物芯片表面的距离称为光程。相对于L, A镜与B镜之间的间距e很小, 可以得出激光光束从振镜A到生物芯片表面的光程为
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(3) |
假设B镜的旋转角速度为wy, 则激光光束在y方向上的扫描线速度为vy=wy·l。
设扫描的物理分辨率为As=n×n, 则As面积的平均照射时间为
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(4) |
根据荧光染料的光动力学理论公式[10]
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(5) |
式中:qem为激发的荧光光子数; p为每个荧光分子受激后所产生的光子速率; As为扫描分辨率; Cs为荧光浓度; ts为扫描时间。其中荧光分子速率p以及相关参数的计算公式为[10]:
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(6) |
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(7) |
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(8) |
式中:Qe为荧光染料的量子效率; N1为激发态的荧光分子数; τf为荧光寿命; α为荧光分子激发速率; I为激发光强; σ为波长相关的吸收截面; hv为吸收光子的能量。
因此, 结合式(1)、式(4) 和式(5) 可得本检测装置的检测数学模型为
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(9) |
测试环境为暗室, 无其他杂散光, 正常室温。测试仪器清单如表 1所示。
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表 1 主要测试仪器清单 Table 1 The main test equipment list |
在y方向上B镜的镜面偏转角度为-4.5°~3.5°, 根据公式(1) 与振镜的位置输出比例系数k可以得出振镜镜面偏转的限制电压值为-2.25~1.75 V。同理, 在x方向上A镜的镜面偏转角度为-5.5°~5.5°, 即输入电压的限制值为-1.4~1.4 V。
在对生物芯片进行检测之前, 必须先对波形发生器所产生的波形进行验证, 防止发生意外导致二维高速振镜损坏, 波形测试完成后就可以对生物进行扫描拍摄。波形发生电路的输出波形如图 6所示, 达到预期的效果, 可以保证二维高速振镜正常工作并且实现弓字形扫描。
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图 6 波形发生器所输出波形 Figure 6 Waveform generator output waveform |
各部分初始化完成后, 根据预先设定好的扫描时间和冷却型CCD相机曝光时间就可以开始测试, 其中各次实验时CCD相机的曝光时间均设置为30.5 s。
4.2 测试方案测试时采用75 mm×25 mm×1 mm的标准载玻片, 以手工方式在该载玻片的较中心位置点样Cy5荧光染料点, 然后将其放在如图 4(b)所示的1至5的五个位置上进行扫描检测(除位置外其他所有条件保持一致)。
由式(9) 可算出图 4中五个位置的激发荧光强度与原点位置激发荧光强度之间的三角函数关系式, 如表 2所示。
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表 2 各个位置的三角函数系数 Table 2 The trigonometric function coefficient in the five positions |
由于冷却型CCD相机H-694ICE-Ⅱ所拍摄的TIFF图片是以16位位图的形式来存储, 并且整张图像的像素数为2 728×2 192, 整张图片较大而目标荧光点较小, 因此可从整张灰度图中截取出荧光点样所在区域的401×401的区域来进行图片的处理。
截取点样区域的荧光图像后, 分别对五个位置的图像进行5×5的中值滤波, 以消除孤立的噪声。滤波处理后选取图 7所示的八个白色正方形区域的背景, 取其平均值作为图像的背景, 通过去除图像的背景得到前景目标, 由于我们的信号目标几乎集中在一个圆内, 因此背景噪声的影响就相对较少。通过在图 7中的中心圆圈提取出前景目标, 通过计算它的灰度值总和获得所检测的荧光微点信息。经过四次实验得到四组数据, 对数据取其平均值并且经表 2的系数校正, 最终得到如表 3和图 8所示的结果。其中表 3所表示的值, 是以图 4(b)中心的“1”位置为标准, 对其他点样进行归一化处理并且经表 2中的对应系数进行校正的结果。
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图 7 选取的背景与前景目标 Figure 7 Background and prospect target |
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表 3 各个位置的灰度原始值、校正值和误差(以中心点1为准归一化) Table 3 The gray original value, corrected value and error in the every position(normalization by center 1) |
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图 8 校正前与校正后的灰度对比 Figure 8 Calibration before and after the correction |
生物芯片检测装置使用二维高速振镜作为激光光路扫描主体, 并且通过STM32控制实现了对生物芯片上指定区域内的荧光点阵的扫描, 简化了生物芯片传统检测装置中复杂的结构。虽然由于激光光束斜照射导致生物芯片表面接收的光强不一致, 导致检测的结果不准确, 但是通过本文所建的数学模型校正后, 可以使整个平面的接收光强几乎一致, 同时使得荧光点灰度图像中的灰度基本一致且误差在2%以内。因此本装置可以应用于生物芯片的检测。
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