近年来，由生物材料和贵金属纳米颗粒组合而成的表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）基底引起了人们极大的研究兴趣。其中，石墨烯、氧化石墨烯等碳材料与生物材料复合，可以通过π-π或静电相互作用辅助待测分析物的吸附，并通过动态电荷转移引入基底的化学增强效应（chemical enhancement，CM）；而贵金属纳米颗粒的加入会在基底表面产生局域表面等离激元共振（localized surface plasmon resonance，LSPR），显著增强局域电磁场强度，进一步提升SERS增强效果^[1-2]。蝉翅是一种动物源性天然生物材料，具有低成本、环境友好等优点。此外，蝉翅表面还具有紧密排列的纳米柱阵列结构，是理想的3D SERS基底支撑材料^[3]。

SERS技术能够提供丰富的分子振动光谱信息，具有高灵敏度、快速检测、强抗水干扰能力及无损检测等优势，是一种性能优异的分析手段^[4-5]。迄今为止，SERS的应用已拓展至诸多领域，包括食品安全^[6-9]、生物传感^[10-12]、环境分析^[13]和化学催化^[14]等。其中，关于生物材料SERS基底的研究正在蓬勃发展。Xu等^[15]通过物理气相沉积法在玫瑰花瓣上镀银，开发出低成本的生物SERS基底。该基底对罗丹明6G（Rhodamine 6G，R6G）的检测极限达到了10⁻⁹ mol/L。玫瑰花瓣表面具有类似纳米槽的分层微纳米结构，不仅在银沉积后提供了SERS热点，还表现出超疏水性。Wang等^[16]在蝴蝶翅膀鳞片上通过化学沉积制备了致密的金纳米颗粒结构，构建出高灵敏度的3D SERS基底。该基底对芬太尼的检测极限达到了4×10⁻¹² mol/L。一只蝴蝶表面大约有数百万个鳞片，每个鳞片都由错综复杂的3D结构组成，这为构建大尺度范围的微纳米结构提供了天然的模板。合理利用植物、动物来源的生物材料，并结合等离子体金属纳米颗粒，是制备SERS基底的有效策略。

本文通过滴加及真空干燥，将氧化石墨烯（graphene oxide，GO）和银纳米颗粒（AgNPs）依次修饰于蝉翅（cicada wing，CW）表面，制备出一种新型AgNPs-GO-CW生物材料基底。GO表面的含氧官能团能够提升基底对分析物分子的吸附能力。当分子被吸附到GO表面时，其内部电势会发生改变，进而增大分子的极化率与拉曼散射截面，并通过动态电荷转移机制增强SERS信号^[17]。同时，GO还能有效猝灭待测分子的背景荧光^[18]。采用传统Lee-Meisel法，用柠檬酸钠还原硝酸银溶液制得AgNPs。蝉翅表面的三维纳米结构可以有效实现“热点”的多维分布，提高激光探测区域内“热点”的收集效率。此外，蝉翅表面特殊的纳米结构赋予其疏水性，该特性可使含待测分析物的液滴经蒸发富集于微小区域，从而实现分析物的浓缩，有利于SERS检测。结果表明，AgNPs-GO-CW基底增强因子可达10¹⁰，可实现对极低浓度R6G（1×10⁻¹³ mol/L）的检测，并具备检测其他痕量分析物分子的潜力。作为实际应用，将其用于掺假奶粉中三聚氰胺的检测，检测限为2.5 ×10⁻⁷ mol/L，低于欧盟与美国食品药品监督管理局规定的限量标准。

1 实验部分 1.1 实验材料

硝酸银（AgNO₃），分析纯，购自上海森灏精细化工有限公司；柠檬酸三钠、三聚氰胺、乙醇和丙酮，分析纯，购自国药化学试剂有限公司；罗丹明6G（R6G，质量分数ω ≥95%），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；单层氧化石墨烯粉（GO，ω ≥95%），购自苏州碳丰石墨烯科技有限公司；蝉翅购自江苏宿迁福蝶标本店。

1.2 银纳米胶体的合成

采用传统Lee-Meisel法制备银纳米胶体。具体制备方法为：首先，配置250 mL浓度为10⁻³ mol/L的AgNO₃溶液；然后，用磁力搅拌器不断搅拌加热AgNO₃溶液直至沸腾；接着，立即加入6 mL柠檬酸三钠溶液（ω = 1%），保持混合溶液煮沸状态大约30 min，直至产生灰绿色胶体，表明银纳米胶体制备成功。胶体在室温环境下自然冷却，并保存于阴凉干燥处，避免阳光直射，以备后续实验使用。

1.3 AgNPs-GO-CW基底的制备

将蝉翅置于丙酮和乙醇的等体积混合溶液中超声清洗后，再于纯水中超声清洗，清洗时间均为5 min，以彻底去除蝉翅表面吸附的杂质。清洗后用氮气吹干，并在蝉翅中心约1 cm×1 cm的范围内滴加20 μL 100 mg/L的氧化石墨烯水分散液，随后在真空干燥箱中40 ℃，干燥1 h。干燥完成后，用移液枪取20 μL银纳米胶体滴加至GO覆盖的蝉翅上，并于60 ℃真空加热10 min，得到AgNPs-GO-CW基底。

1.4 AgNPs-GO-CW基底的表征

采用场发射扫描电子显微镜（Quanta FEG 250）观察蝉翅与AgNPs-GO-CW基底的微观结构形貌；采用荧光光谱仪测量不同浓度的GO水分散液对染料分子R6G的荧光抑制效果；采用Evolution 350紫外可见分光光度计和Zeta电位仪对银纳米颗粒进行表征；采用Theta水滴角测量仪测量AgNPs和GO修饰前后蝉翅的疏水性变化。

1.5 SERS检测

实验过程中，拉曼光谱和SERS采用纳米光子拉曼光谱仪（RAMAN-touch，日本纳福通株式会社）采集，激发波长为532 nm，激光功率为0.1 mW，单谱采集时间为1 s。所得拉曼光谱及SERS使用RAMAN Viewer软件进行处理。

采用R6G水溶液作为拉曼探针分子。首先，配制浓度为10⁻⁴ mol/L的R6G溶液；然后，采用逐步稀释的方法得到10⁻⁵～10⁻¹³ mol/L的9个浓度梯度的R6G溶液。依次取20 μL不同浓度的R6G溶液滴加至AgNPs-GO-CW基底上。蝉翅表面的微观结构赋予其优异的疏水性，液滴在其表面易于保持球形，自然干燥后可将探针分子有效富集于微小区域，随后进行SERS检测。

2 结果与讨论 2.1 GO荧光抑制的性能评价

在SERS传感器的开发中，常引入石墨烯基材料以增强目标分析物的SERS信号。在基底的制备过程中加入氧化石墨烯，不仅能有效抑制分析物的荧光干扰，还可引入化学增强效应，进一步提升SERS信号强度。在拉曼检测中，过强的荧光会掩盖分析物的拉曼信号，因此荧光干扰是实验中需要重点规避的问题。为了分析GO的荧光抑制能力，配制了30、50、100、150、200 和250 mg/L 的6种不同质量浓度的GO水分散液。按1:1的体积比，将GO水分散液与R6G溶液超声混合均匀，并测量混合后的R6G的荧光光谱。由图1（a）可知，当激发光波长为405 nm时，R6G在555 nm附近有一个较强的发射峰，且随着GO分散液质量浓度的增加，发射峰强度逐渐减弱。这表明，GO可以有效抑制分析物的荧光干扰。图1（b）为采用不同浓度GO制备的AgNPs-GO-CW基底对R6G的SERS光谱。尽管GO质量浓度越高，对荧光背景的抑制效果越好，但GO质量浓度过高时，其自身较强的D峰与G峰会对分析物的SERS信号产生干扰。结果表明，100 mg/L的GO为本研究中的最佳质量浓度。

2.2 银纳米胶体的优化

采用Evolution 350紫外–可见分光光度计对银纳米胶体进行表征，得到300～800 nm波段的紫外–可见吸收光谱。图2（a）显示，银纳米胶体在402 nm 附近出现较强吸收峰。该峰为银纳米粒子的典型特征吸收峰，主要源于银的LSPR，表明银纳米胶体制备成功。为进一步确定银纳米粒子的粒径分布情况，采用Zetasizer电位仪（Malvern Nano–ZS90，英国）进行动态光散射实验，测量银纳米粒子的粒径分布。图2（b）为所制备银胶体的动态光散射图。结果显示，其粒径主要集中在64 nm，但在6 nm附近也存在少量分布，说明所制备的银胶体中含有少量小尺寸的纳米颗粒。在以银纳米胶体作为SERS增强基底时，颗粒尺寸不均会影响“热点”分布，导致SERS信号整体均匀性下降。因此，需对其进一步优化，以获得粒径分布更均匀的胶体，从而提升SERS信号的稳定性。为进一步提升银胶体的增强效果，采用差速离心法对其进行优化。首先，取8 mL银胶体置于离心管中，以2 000 r/min低速离心3 min，小粒径及中等粒径的纳米颗粒富集于中间层与上层，大粒径纳米颗粒则沉降至离心管底部。随后，吸取上层约5 mL悬浮液，转移至另一洁净离心管中，加入3 mL的超纯水，以9 000 r/min高速离心15 min。此时，较小的银纳米颗粒与未反应杂质悬浮于中上层清液中，用移液枪弃去上清液，收集底部浓缩的银胶体沉淀，并加入适量的超纯水超声10 min，使其均匀分散。为验证差速离心后银胶体颗粒分布情况，再次测量其紫外–可见吸收光谱，结果如图2（a）所示。经两次差速离心优化后，银胶体吸收峰的半高全宽较未离心样品更窄，表明优化后的银胶体颗粒尺寸分布更集中。接着，采用动态光散射实验测量了优化后银胶体的粒径分布，结果如图2（c）所示。结果表明，差速离心法可以有效去除不同粒径的纳米颗粒，提高胶体的均匀性。基于紫外可见吸收光谱和动态光散射的结果，证明通过差速离心法，可以获得粒径更加均匀的银纳米粒子。

2.3 基底微观表征与分析

实验中所用样品为蝉上翅，蝉翅标本购自江苏宿迁福蝶标本店。选择蝉翅作为基底，主要因其廉价易得、绿色环保，且表面具有天然纳米柱阵列结构。通过滴涂和真空干燥的方式，将GO与AgNPs依次修饰于蝉翅的表面。图3（a）和（b）所示为蝉上翅表面的俯视和侧视（45°倾斜）SEM图像。图中可观察到大面积、致密的突起纳米结构。该类突起呈圆锥形，并已被证实有利于提升表面疏水性，能促使分析物分子在表面富集，加强表面拉曼散射增强效应^[19]。将SEM图像导入数值计算软件，对纳米突起阵列的直径、间距和高度进行统计，结果分别约为120 nm、55 nm和250 nm。图3（c）为AgNPs-GO-CW基底的SEM图像。经AgNPs与GO修饰后，蝉翅仍然具有原始的周期性特征结构，其初始形态在很大程度上得以保留。为了比较蝉翅经GO和AgNPs修饰前后疏水性的变化，使用Theta水滴角测量仪（Biolin，瑞典）测量接触角（contact angle，CA），对应结果见图3（a）和（c）中的插图。修饰前蝉翅表面的CA高达137.6°，修饰后蝉翅表面的CA为120.9°，说明蝉翅在修饰前后始终保持良好的疏水性。图3（d）为Ag在AgNPs-GO-CW基底表面的元素图谱，结果表明，银纳米粒子在蝉翅表面整体分布均匀。

本研究利用的是蝉翅生物材料的疏水性，因此有必要对其疏水性能做进一步分析。负载于AgNPs-GO-CW基底上的分析物分子，在液滴干燥蒸发过程中会逐渐富集，进而使SERS信号增强。该基底表面呈Cassie Baxter状态，其典型特征为水接触角滞后，液滴在此状态下倾向于保持球形。为分析蝉翅表面性质，将20 μL染料溶液滴于其表面，并用相机拍摄记录。将记录结果导入数值计算软件以计算液滴直径，同时选用无任何表面微结构的载玻片作为对照。结果表明，蝉翅表面的液滴直径显著小于载玻片上的液滴直径，而液滴直径取决于材料自身的疏水性。如图4（a）所示，疏水生物材料可以有效将分析物分子集中在液滴中。为进一步验证蝉翅的拉曼增强效果，选取10⁻⁶ mol/L的R6G作为拉曼探针分子，对比了AgNPs-GO-CW基底和AgNPs-GO-载玻片基底的拉曼增强效果。如图4（b）所示，AgNPs-GO-CW基底对R6G的增强效果显著优于AgNPs-GO 载玻片基底。测量结果进一步表明，疏水表面能够在液滴的蒸发过程中有效促进分析物的富集，从而提高检测灵敏度。

2.4 AgNPs-GO-CW基底的SERS性能评价

R6G具有完善的振动特性，被用作拉曼探针分子来评价AgNPs-GO-CW基底的SERS性能。首先，通过测量不同浓度（10⁻⁵～10⁻¹³ mol/L）R6G的SERS信号来评价基底的灵敏度。在基底上依次滴加20 μL不同浓度的R6G溶液，室温自然蒸发后，测量其SERS光谱。如图5（a）所示，R6G在611、774、1 365和 1512 cm⁻¹处的主峰清晰可见。611 cm⁻¹处峰与C－C－C面内弯曲振动有关；774 cm⁻¹处峰与C－H面外弯曲振动有关；1 365 cm⁻¹处峰与C－C伸缩振动有关；1 512 cm⁻¹处的特征峰源于芳香族C－C伸缩振动^[20-21]。R6G的SERS信号强度随浓度降低而减弱，但即便在10⁻¹³ mol/L的超低浓度下，其特征主峰仍清晰可辨。AgNPs-GO-CW基底具有极低的检测浓度下限，这一现象可能与其表面疏水性密切相关。将R6G溶液滴加至基底后，表面疏水性可促使液滴形成近球形结构；在液滴缓慢蒸发过程中，R6G溶液不断浓缩并被限制在微小区域内，进而显著提升分析物的富集效率。由图5（b）可知，在10⁻¹³ ～10⁻⁸ mol/L范围内，R6G在611 cm⁻¹处峰的SERS信号强度与R6G浓度的对数呈良好的线性关系，拟合曲线方程为y = −1 527.23 x+20 557.67，线性回归的决定系数R²为0.974 9。为了更直观地验证该SERS复合材料基底的灵敏度，在硅片上测量了10⁻² mol/L R6G溶液的常规拉曼光谱，并在AgNPs-GO-CW基底上测量了10⁻¹³ mol/L的R6G溶液的SERS光谱，以评估基底的增强因子（enhancement factor，EF）F_e，测量结果如图5（g）所示。F_e计算式为

$ F_{\mathrm{e}}=\left(I_{\mathrm{SERS}} / N_{\mathrm{SERS}}\right) /\left(I_{\mathrm{NRS}} / N_{\mathrm{NRS}}\right) $

式中：I_SERS和 I_NRS分别为SERS和常规拉曼散射（normal Raman scattering，NRS）中分子特征峰强度；N_SERS和N_NRS分别为SERS和常规拉曼散射中有贡献的分子数，其计算式为

$ N=\left(\frac{{N}_{A}M{V}_{\text{solution}}}{{S}_{\text{sub}}}\right){S}_{\text{laser}} $

式中：$ {N}_{A} $为阿伏伽德罗常数，约为6.02×10²³；M为滴加在复合材料上R6G溶液的浓度；V_solution为滴加的溶液体积；S_sub为基底的有效面积（约4 cm²）；S_laser为探测激光光斑面积（直径约5 μm）。经计算，611 cm⁻¹和1 647 cm⁻¹处基底的增强因子分别为2.64×10¹⁰和4.22×10¹⁰。较高的增强因子为实现低浓度分子识别提供了有利条件。但需要说明的是，增强因子易受实验参数及光谱仪参数影响^[22]。

除灵敏度和定量检测能力外，SERS信号的均匀性也十分重要。图5（c）为在AgNPs-GO-CW基底上随机20个点检测到的10⁻⁶ mol/L R6G的SERS光谱。611 cm⁻¹处的特征峰强度值分布如图5（d）所示，不同点之间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）D_r,s约为10.71%，表明复合材料基底具有优异的均匀性。这可归因于蝉翅表面有序的纳米柱阵列结构与粒径分布集中的银纳米胶体。此外，先后制备了5个不同批次的AgNPs-GO-CW基底，各批次R6G的SERS光谱如图5（e）所示。图5（f）为R6G在611 cm⁻¹处的拉曼峰强度分布直方图，相应的RSD为4.57%。结果表明，不同批次制备的基底表现出良好的可重复性。因此，AgNPs-GO-CW基底是SERS检测中一种可靠的基底。此外，稳定性也是评估基底性能的重要参数之一。图5（h）为10⁻⁷ mol/L的R6G在新制备的AgNPs-GO-CW基底及室温保存25 d后基底上的SERS光谱。与新制备基底相比，室温保存25 d后的基底在611 cm⁻¹处的SERS信号强度由24 019降至19 735，仍保留初始强度的82.16%；在1 647 cm⁻¹处的信号强度由20 407降至16 222，仍保留初始强度的79.49%。室温放置25 d后，R6G特征峰对应的SERS信号整体仅衰减约20%，信号强度变化缓慢。上述结果表明，AgNPs-GO-CW基底具有良好的时间稳定性。

2.5 应　用

理想的SERS基底还应具备检测多种分析物的通用性。三聚氰胺是一种富氮化合物，因其含氮量高，常被非法添加至奶粉及乳制品中，导致基于总氮含量测定的蛋白质检测结果偏高^[23]。摄入人体的三聚氰胺会在肾脏中转化为不溶性三聚氰胺氰尿酸酯晶体，对肾脏造成严重损害，甚至导致肾衰竭，严重时甚至造成死亡^[24-25]。世界卫生组织规定，牛奶中三聚氰胺的最大残留限量为2.0 × 10⁻⁵ mol/L，婴儿配方奶粉中的最大残留限量为7.9 × 10⁻⁶ mol/L ^[26]。因此，检测奶粉中是否违法添加三聚氰胺具有重要意义。基于此，选择三聚氰胺作为验证基底通用性的目标物质。

首先，制备三聚氰胺（10⁻⁴ mol/L）和奶粉（5 g/L）标准溶液。随后，将三聚氰胺和奶粉标准溶液以适当比例混合，混合样品（掺假奶粉溶液）中三聚氰胺浓度分别为20.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.50和0.25 μmol/L。图6（a）为三聚氰胺固体粉末和奶粉固体粉末的常规拉曼光谱，两者基本无重叠，说明奶粉不会对三聚氰胺的测量造成影响。三聚氰胺固体粉末在582、674和982 cm⁻¹处的拉曼峰清晰可见。582 cm⁻¹处的峰归属于N－C－C弯曲振动和－NH₂扭转振动；674 cm⁻¹处的峰归属于三嗪环的环呼吸Ⅱ模式；982 cm⁻¹处的峰与三嗪环的环呼吸Ⅰ模式有关。所测的三聚氰胺拉曼峰与已有报道一致^[27-28]。图6（b）为掺假奶粉溶液和未掺假奶粉溶液的拉曼光谱及SERS。除了掺假奶粉溶液的SERS外，其他3组均未检测到明显的拉曼信号。另外，三聚氰胺掺假奶粉溶液（20 μmol/L）在基底上的SERS与三聚氰胺固体粉末拉曼光谱特征峰的位置略有不同，峰位的变化可归因于银纳米粒子与三聚氰胺之间的相互作用。主要表现为，674 cm⁻¹处的峰红移至700 cm⁻¹处，红移原因与三聚氰胺分子通过杂环氮原子以垂直或轻微倾斜的方向吸附在AgNPs表面有关^[29]。结果表明，采用AgNPs-GO-CW基底检测奶粉中的三聚氰胺具有可行性。该基底通用性良好，可直接识别奶粉溶液中的三聚氰胺分子，无需复杂的样品预处理。观察三聚氰胺最强特征峰（700 cm⁻¹），发现该峰的SERS信号强度随着三聚氰胺浓度的降低而减弱，如图6（c）所示。图6（d）表明，位于700 cm⁻¹处的SERS信号强度与三聚氰胺浓度（0.25～20.00 μmol/L）呈良好的线性关系。拟合曲线方程为y = 269.76x+489.41，线性回归的决定系数R² = 0.9673，线性相关性良好。该方法不仅可实现三聚氰胺的定性检测，还能通过SERS光谱中三聚氰胺的特征峰强度定量计算乳制品中的三聚氰胺浓度。利用AgNPs-GO-CW基底实现了掺假奶粉中浓度为0.25 μmol/L三聚氰胺的检测，该检出限低于世界卫生组织规定的限量值。

3 结　论

综上所述，通过在蝉翅上依次沉积GO与AgNPs，成功制备了柔性、低成本且具有高SERS性能的生物材料基底。蝉翅表面天然存在的纳米柱阵列为三维结构构建提供了理想模版，其表面疏水特性有助于降低检测下限。GO可有效抑制拉曼测试中分析物分子的荧光信号。经差速离心优化的银胶体赋予基底优异的SERS性能。以R6G作为探针分子的SERS测试结果表明，AgNPs-GO-CW基底具有超高的SERS增强效果（F_e= 10¹⁰）、优异的SERS灵敏度（检测限为10⁻¹³ mol/L）、良好的信号均匀性（RSD为10.71%）、优异的批次间重复性（RSD为4.57%）和良好的时间稳定性。此外，该基底具有良好的通用性，不仅可用于R6G的痕量检测，还可实现对掺假奶粉溶液中三聚氰胺的定性与定量检测。即使三聚氰胺浓度低至0.25 μmol/L，该基底仍能清晰识别其主要特征峰。该基底为三聚氰胺检测提供了一种补充手段，具有潜在的实际应用价值。