引　言

激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术^[1-2]。CLSM用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，其优良的性能在半导体^[3-4]、材料科学^[5-6]、生物医学^[7-8]等领域具有广泛的应用。

激光扫描共聚焦显微镜系统采用精密的针孔滤波技术，使其不仅能够保持高清晰度和层析成像能力，同时能对不同荧光成分选择成像，确定荧光成分的含量^[9]。在光谱成像共聚焦显微镜中，有多种分光方案，张运海等利用棱镜分光移动狭缝的方法，得到了5～300 nm波长分辨率的荧光图像。李叶等利用不同的带通滤波片得到不同波段的荧光^[10]。目前市面上的激光共聚焦扫描显微镜采集系统部分采用可调谐带通滤波片和光电探测器连用，其最高分辨率为10 nm左右。对于观察半导体微纳材料的自吸收，例如单层二硫化钼、硒化镉纳米带、纳米线^[11-13]等其荧光峰值波长改变量不足1 nm，因此具有测量高精度波长分辨率的荧光显微镜是必要的。

1 系统构成

测量荧光光谱系统采用的是普通光学显微镜改装的激光扫描成像显微镜，如图1所示，主要包括激光光源、光学显微镜、纳米移动台、二向色镜、聚焦镜以及光谱仪组成。激光器选用的是波长为532 nm的激光器，激光器发出的激光光斑直径为1 mm，所以要先对激光进行缩束，利用两个不同焦距的凸透镜搭成的望远镜光路将光斑缩小为100 μm。激光通过二向色镜反射进入100倍的聚焦物镜中进一步将光斑缩小，缩小的光斑照射在样品上使样品激发荧光，并通过物镜进行荧光收集，所得的光经过聚焦镜聚焦后将荧光通入光谱仪进行采集。纳米移动台对样品区域进行移动扫描，纳米移动台的行程为4 mm，位移精度10 nm，能够达到实验所需精度。

2 程序设计 2.1 软件设计

图2为荧光图像系统的结构功能图，其主要包括系统配置和数据采集两个方面。系统配置是将实验仪器的通讯以及参数进行设置，数据采集是利用本套系统能够得到的所有数据信息。图3是采集程序的程序面板和流程图。进入程序后，首先进行系统配置，需要将激光器、光谱仪、纳米移动台的设备串口编号选择输入程序，并对仪器进行初始化。初始化完成后，选择本次采集所得文件的存储目录，设置光谱仪的积分时间、滤波参数、纳米移动台的起始位置和终止位置以及采集步长，确定采集分辨率。系统设置完成后，点击确定进入数据采集，在数据采集界面中实时显示纳米移动台在每一次移动时获得的光谱，将光谱的荧光峰值强度以及波长挑选出来，绘制在强度三维图和波长三维图中。界面中有一个采集时间显示模块，可以观察本次采集已经经过的时间以及距离完成所需的剩余时间，方便操作者得到采集数据。

2.2 光谱仪信号处理

光谱仪的原理是使用光栅分光后将光打入线阵CCD中，将光信号转化为电信号。使用的过程中会有热噪声，测试背景产生的其他光噪声以及数据采集卡的模拟干扰信号，所以要对光谱仪采集的信号进行处理以提取想要获得的信号。针对三种噪声，本文采用均值滤波、低通滤波^[14]以及背景扣除法^[15]来处理采集到的信号。

均值滤波是信号处理的常用方法，它有着计算速度快和容易实现等优点，其原理是对光谱仪多次采集的波长强度信号加权平均，得到的平均值作为光谱仪采集的强度值。

低通滤波采用的是FIR (finite impulse response)滤波器滤波，它可以在保证任意幅频特性的同时具有严格的线性相频特性，同时保证其单位抽样响应是有限长的，其原理是信号通过一个FIR滤波器与其系数进行卷积（即乘累加）的过程。在本实验中主要使用其低通功能，将光谱仪采集的高频信号进行滤除。

光谱仪在无光条件下会产生暗电流，在开启后遮挡住进光口，对其信号进行收集，并和后来采集到所需要的信号值进行相减以扣除暗电流噪声。

在对光谱仪信号采集的过程中，使用上述三种滤波方法依次对光谱仪采集的初始信号进行滤波。将经过三种滤波后的图像进行对比如图4所示，其中图（a）为未经滤波光谱仪的信号图谱，图（b）为滤波后光谱仪信号图谱，可以看到，在滤波前光谱仪的信号平均强度在1 150左右，噪声幅值有200，信号几乎无法观察。经过滤波后，无信号的波长强度值在0附近，噪声幅值仅有20，能明显观察到560～740 nm波段的信号。

3 图像分析比较

将光谱仪测得的强度信息和波长信息进行提取，以纳米移动台的横纵坐标为XY轴，强度和波长信息作为Z轴即可得到荧光强度图像和荧光峰值波长图像。图5（a）（d）（g）分别是单层二硫化钼、硒化镉纳米带和硒化镉纳米线在照明光下的显微镜图，图5（b）（e）（h）是利用荧光成像系统采集对应荧光强度图以及（c）（f）（i）是采集对应荧光峰值波长图。每种样品采集的图像在照明光下的实际长度和使用搭建的系统的边长对比如表1所示。

表1中实际长度是在照明光条件下利用CCD相机进行测量所得的长度值，步进长度为纳米移动台每次采集所前进的步长，像素数为采集图像转为bmp格式图片后测量边长所得的像素点个数，步进长度与像素数的乘积即为扫描系统所采集的长度。从表中可以看出，利用荧光成像系统采集的长度与实际长度的误差值在1 μm以内。

观察图4的荧光强度图像（b）（e）（h），发现在硒化镉纳米带两端强度最高，其最高强度值为588，而在纳米带的中间部分强度值明显低于两端仅有220左右，硒化镉纳米线也有相同的现象，即在两端的强度明显高于中间，而对于微纳材料单层二硫化钼的强度其边缘处的强度与中间的强度相差不大。上述现象说明硒化镉纳米材料中存在一种导波模式，当激光照射激发其本征荧光时，荧光一部分向外部发射，另一部分在样品端部表面进行多次全反射，在纳米线的两端进行积累，形成类似于FP腔的循环增益结构，最终荧光从两端射出。当激光激发位置在两端时，采集到的荧光包括外部发射的荧光以及在纳米材料表面传输的光波，强度明显高于中间位置。而在单层二硫化钼中，由于材料厚度太小（0.8 nm），在微纳材料表面传输的光无法通过端面反射返回原来位置，不能形成类似于FP腔的增益结构，表面的光波从微纳材料的任意边界射出，边界处的荧光强度略微高于中间。

观察图5的荧光峰值波长图像（c）（f）（i），发现硒化镉纳米带和纳米线两端的最强波长与中间的最强波长不同，其两端波长相对中间发生了红移，相比于中间移动了3 nm左右。单层二硫化钼则没有发生红移，其中部与边缘仅仅只是强度差异。这是因为在硒化镉纳米线中由于荧光在两端的强度大，导致硒化镉的自吸收效应使发射波长发生红移。

将图5采集微纳材料的荧光峰值强度图与荧光峰值波长图作为对比，发现荧光峰值波长图所测量的大小明显大于荧光峰值强度图。因此将采集硒化镉纳米带的波长三维图以及强度三维图的横截面与利用原子力显微镜（AFM）所测量的纳米带宽度的截面信息进行作图，结果如图6所示。图6（a）为硒化镉纳米带的波长截面图，图6（b）为硒化镉纳米带的强度截面图像，图6（c）为硒化镉纳米带的宽度截面图。我们可以观察到采集的两张三维图的长度均比实际长度长，利用AFM测量纳米带的宽度为1.682 μm，强度截面所得到的宽度为2.4 μm，波长截面图的长度与实际长度相差最大为4.2 μm。因为在进行高分辨率采集时，由于激光光斑的大小限制，微纳材料边缘的荧光会从小到大逐渐增强直至光斑完全照射在微纳材料上，而荧光峰值波长只需要产生荧光就可以采集到相近的波长，最终在显示时由于荧光强度在比较低时显示程度较弱，荧光峰值波长图所测量的大小明显大于实际长度，导致在测量纳米级别的长度时导致图像不准确。

4 结　论

本实验采用的是利用光谱仪和显微镜系统搭建的实验装置，光谱仪可以采集出目标点350～900 nm的可见光全光谱，并可以将所有扫描点的光谱图保存起来便于分析。利用光谱仪直接读取样品激发的荧光信号，设置采集的积分时间，观察较弱的荧光信号可以进行长时间的积分曝光来提高信噪比可以得到荧光的波长信息和强度信息。同时由于光谱仪依靠光栅分光，可以得到高精度的荧光信号。依靠本实验制作的荧光扫描显微镜可以分辨出最小0.03 nm的波长差异，相比于普通的共聚焦显微镜在波长分辨方面有着较大的提高。

同时利用LabVIEW软件的读取功能，在完成该点扫描后立即得到所需要的数据并在全部扫描后，得到所需的强度图像和荧光图像，并分析得到的图像产生的误差的原因。根据这些图像信息经过处理可以精确的显示微纳材料不同位置的发光强度差异以及发光波长差异，能够更好地研究微纳材料的结构信息以及生长缺陷。