引言

光学显微镜是研究物质微观领域的重要手段,尤其是在生物医学^[1-3]和材料科学^[4]等领域。普通光学显微镜在成像分辨率和聚焦深度上存在明显缺陷^[5-8]。激光共焦显微镜采用与传统光学显微镜完全不同的成像技术,具有很好的成像质量和层析成像能力,可用于观察活体样本的深度组织。

在共焦显微镜成像中影响图像分辨率和清晰度的因素主要有噪声和离焦量,其中噪声主要包括随机噪声和工频噪声。采用斯坦福公司的MODEL SR570前置放大器能够很好地抑制随机噪声,在数据处理时以均值滤波的方式进一步滤除随机噪声。对于交流电产生的工频噪声,本文选择高斯函数构造数字低通滤波器的方法进行滤除。

由于德国PI公司的位移台在移动过程中会使系统机械结构抖动,造成系统离焦,降低图像质量。对图像的离焦模糊处理方法有盲复原和非盲复原两种方法。非盲复原包括逆滤波算法和维纳滤波算法。逆滤波算法在有些区域使得传递函数为零或者很小时,噪声会在这些区域被放大,严重影响了图像的复原;维纳滤波复原算法效果良好,计算量低,并且具有很好的抗噪性。盲复原中的迭代盲解卷积算法简单直观,有继承性,并且能将逆滤波、维纳滤波复原算法应用于其迭代过程中。因此,本文在图像复原中采用迭代盲解卷积算法。

1 反射式LCSM的工作原理

激光共焦扫描显微镜(LCSM)采用共轭焦点技术,使激光光源、被探测点和探测器处在彼此对应的共轭位置^[9]。用于激发荧光的激光束经过准直系统后通过显微物镜会聚,入射于待观察的标本内部焦点处,激光照射所产生的荧光和少量反射激光一起被物镜重新收集后,送往分光镜,其中携带图像信息的荧光由于波长比较长直接通过分光镜,并由收集物镜聚焦到探测器。由于分光镜的分光作用,残余的激光被分光镜反射,不会到达探测器。PI位移台载着待测样本按照指定扫描路径运动,从而完成对样本的扫描采集,然后经计算机处理,显示出样本细胞图像,整个系统如图 1所示。在焦平面之前的光在探测器针孔的后端聚焦,大部分光被针孔光阑的边缘所阻挡,无法到达探测器,在焦平面之后的光聚焦在探测器针孔之前,大部分光扩散在针孔光阑的边缘,也无法到达探测器。焦平面上的光都聚焦在探测器针孔上,可以被探测器完全探测。这种能够抑制焦平面之外杂散光的特性赋予了共焦显微镜进行深度鉴别和层析成像的本领。

2 改善LCSM像质的方法 2.1 选择针孔大小

LCSM探测针孔大小起着至关重要的作用,会直接影响系统的轴向分辨率和信噪比。如果针孔过大,会引入杂散光,失去层析能力;如果针孔太小,则会降低到达探测器的光强,对探测器灵敏度具有较高的要求,同时影响图像的信噪比。研究表明^[10],当小孔直径等于艾里斑的直径时,探测效率可达85%以上,且能满足共焦的要求。物镜聚焦光斑经过无限远光学系统放大后,其在针孔处像的直径为

(1)

式中:β为系统的放大倍率;λ为入射光波长;NA为系统的数值孔径。该系统β=40,λ405 nm,NA=0.95,根据式(1)计算得到艾里斑像的大小为20 μm。因此,该系统选用直径为20 μm的针孔。取样间隔遵循的原理是衍射极限定理,能够区分两个艾里斑的取样间隔为艾里斑半径。因此,将取样间隔定位在0.25 μm左右时,即可满足高分辨率图像的要求。

2.2 数字滤波处理方式

随机噪声具有很宽的频谱,若采用低通滤波,会造成图像的细节丢失。在避免细节丢失的处理中,传统多帧求平均方法会使扫描时间成倍增加。为此,本文提出了一种基于均值滤波滤除随机噪声的方法。

对于均值滤波滤除随机噪声的方法,由于数据采集卡的采样频率较高,在位移间隔内可以采集很多点(假设采集K个数据点),将这些值累加后平均或者加权求平均即为该点的能量值。

由于数据采集系统中使用工业电,因此数据采集的质量在很大程度上受到50 Hz工频的干扰,采集到的图像数据中将会包含工频干扰,严重影响重构图像的精度。此外,光电倍增管接收到的荧光信号的强度很弱,在进行荧光信号采集的过程中,很容易受到该噪声干扰,会直接影响显微图像的清晰度。采用高斯低通滤波器滤除工频噪声,其中滤波参数为σ=0.01,滤波方差为2σ²,滤波半径为3σ。实验表明,该滤波器能够很好地滤除工频干扰信号并且显微图像没有明显失真现象。图 2为采集数据中的某一行滤波前后的结果。

2.3 扫描系统的离焦

共聚焦显微镜通过安装在物镜和检测器之间的针孔光阑来阻止非焦平面上的杂散光,仅使焦平面上的光通过。在实验过程中,由于系统机械结构的抖动会造成系统的离焦,图像的质量降低。焦平面上的样品图像呈星点云状,当用高分辨率观察时,每一个点实际就是一系列小的同心环,如图 3所示;如果稍微偏离焦平面,很多更大的同心环就会在对应的成像位置显示,如图 4所示。

离焦的程度受物镜与景物间的距离影响。离焦模糊点扩展函数为

(2)

式中r为离焦圆斑的半径,式(2)对应的频域传递函数为

(3)

式中J₁是第一类贝塞尔函数。

在迭代的过程中,分别对目标图像和点扩展函数分别施加各种限制,例如支持域限制、正则限制等。对于频域采用维纳滤波器来实现,其设计公式为

(4)

(5)

式中S_ff(u,v)、S_hh(u,v)、S_nn(u,v)分别是原始图像、点扩展函数和噪声的功率。在算法求解的过程中,这几个功率谱一般都是未知的。因此式(4)、(5)中出现的功率谱比值通常用一个较小的值来代替。其基本的迭代步骤为:

1) 由图像频域表达式G和,得到新的估计H;

2) 由第1)步求出的H经傅里叶逆变换得到h,在h的基础上加上约束条件,得到的结果经过傅里叶变换得到,由G和得到新的估计F;

3) 由第2)步求出的F经傅里叶逆变换得到f,在f的基础上加上约束条件,得到的结果经过傅里叶变换得到;

4) 由第3)步得到的和G算法回到第1)步进行迭代,重复步骤1)~3);

5) 迭代结束,f即为盲解卷积后的图像数据。

3 实验结果

选用波长为405 nm的半导体激光器,老鼠神经细胞(平均尺寸约为10 μm)作为样品进行实验,实验结果如图 5所示。从图中可以看出,滤波前的图像很模糊,经过高斯低通滤波后,可以看到浅色部分是离焦造成的模糊,盲去卷积后消除了离焦带来的模糊,而且部分细胞可以分清细胞膜和细胞核。

4 结 论

本文研制了基于工作台连续运动的LCSM系统,完成了系统控制、数据采集的任务,并且分析了改善激光共焦扫描显微镜系统图像质量的方法,在此基础上完成了软件的开发工作,若纳米位移台造成的机械抖动能够解决,同时采用盲去卷积的方法,还能进一步提高图像的质量。