LED(light-emitting diode)发光二极管是一种能将电能转化为可见光的固态半导体器件。由于LED这种新型照明光源既节能又环保,被认为“白炽灯照亮20世纪,LED将照亮21世纪”,也因此发现蓝光LED的3人获得2014年诺贝尔物理奖。国外很快把LED这种新型光源应用到新研制的荧光显微镜中,但这种产品价格昂贵,极少有医院购买。目前大量使用的荧光显微镜都是采用老式的汞灯,为了克服汞灯照明的缺点,本文根据医院工作的需要,通过反复实践和改进,把LED新型光源应用到现有的荧光显微镜中,并取得了满意的结果。同时也将CCD(charge-coupled device)摄像装置应用到现有的荧光显微镜中,大大扩展了荧光显微镜的功能。

在十二五期间,医院获得很多国家级课题和省部级课题。这些课题离不开显微镜的使用,而实际情况是大多数显微镜功能老化,跟不上国外医用光学仪器的发展,同时存在着以下几个问题:(1) 显微镜视场不清晰; (2) 显微镜照明功能障碍,照明不均匀; (3) 观察细胞的光线太弱; (4) 视场切割。因此,必须对在用的仪器进行改造,使显微镜功能可靠和操作简化。经过显微镜性能测试,本文选择对正置荧光显微镜进行改造。

荧光显微镜是医院科研、病理、检验等部门常用的医用光学仪器之一。因为普通的显微镜是在明亮的背景上观察暗物,而荧光显微镜是在暗背景下观察彩色的图像,因此它比普通的显微镜分辨力提高100倍,可以观察到普通显微镜看不到的细节^[1]。但是它的调整,校正难度较高,只要解决了荧光显微镜的问题,其它显微镜问题就迎刃而解。

图 1是透射式荧光显微镜的光学系统图。由汞灯发出的各种谱线的光线,经激发滤光片后只让某一种波长的紫外光线通过,如波长为404.7 nm蓝紫光,经反光镜后,激发样品产生荧光。激发滤光片将其他波长的光线滤掉,并使样品激发荧光,所以称其为激发滤光片。通常,激发产生的荧光波长比激发样品的光的波长大得多,是可见光。这样产生的荧光和透过样品的一部分激发光(紫外光),经物镜成像后,人眼即可用目镜观察荧光图像。为了防止紫外光进入目镜视场,降低图像衬度和损伤人眼,放置了一块截止滤光片,它只让某一部分波长的谱线通过,如只让 500~750 nm的可见光通过,而不让500 nm以下的光通过。

图 1

Fig. 1

图 1 荧光显微镜光学系统 Fig. 1 Optical system ofa fluorescence microscope

从图中可以看出,光源是荧光显微镜主要组成部分,

图 2

Fig. 2

图 2 汞灯的发射光谱Fig. 2 Emission spectrum of mercury arc lamp

高压汞灯调整非常复杂,调整步骤如下^[2]。

(1) 开启汞灯后,在显微镜工作台上放1张白纸,并从物镜转换器中转出物镜,即转换器上出现的空孔位于光轴上,卸去转换器上保护盖(如无空孔,可卸掉1个低倍物镜,校正完毕后再旋上)。拉(或转)动显微镜主体内的滤光片座,选用透过绿光的滤光片组,使反射照明有光通过物镜转换器孔,此时在白纸上可看到汞灯照亮的光斑。如光斑太亮,如图 3(a)可以插入中性滤光片,或戴上太阳眼镜,以保护眼镜。

图 3

Fig. 3

图 3 汞灯调焦和校正步骤Fig. 3 focus and alignment procedure of a mercury arc lamp

(2) 转动聚光镜调焦旋手3,见图 4,使汞灯光弧在白纸上成像清晰,因汞灯室内装有1个用来增加亮度的球面反光镜,于是在白纸上看到2个光弧的像,见图 3(a)。旋转2个汞灯调节旋手4、8和2个反光镜位置调节旋手5、7,使2个光弧并立,见图 3(b),再转动反光镜聚焦调节旋手6,使2个光弧有接近相等的亮度,见图 3(c)。

图 4

Fig. 4

图 4 汞灯灯室Fig. 4 Mercury lamp chamber

(3) 旋转2个汞灯调节旋手4、8和2个反光镜位置调节旋手5、7,使2个光弧重合,再调节聚光镜调焦旋手3,得到放大并且均匀的光弧像,见图 3(d),这样汞灯校正工作就完成了。转入物镜后,根据物镜具体倍率,稍微调节一下聚光镜调焦旋手3就可以了。

从开始调整到结束要1 h左右,这对非专业人员是很难完成的,所以,更换一个灯就要请专业公司人员来重新调整一次,这样工作量很大,影响科研工作的进度。总之,使用高压汞灯作光源,除了调整复杂外,还具有易损耗、视场不清晰、照明不均匀等缺陷。

3.1 LED和汞灯对比

(1) 汞灯是会发射出对人体有害的紫外波长的光,而LED光源发射特定波长的激发光,能够有效地激发样品,不存在紫外幅射,能有效确保使用安全。

(2) 汞灯寿命一般为200~400 h,而LED使用寿命达到50 000 h,比传统的汞灯提高100倍,极大延长了使用寿命,降低了成本。LED因输出强度高,波长稳定好,能确保激发有效性。

(3) 汞灯开关一般要预热30 min,而LED光源为实时开关,不需要预热和冷却。

(4) 汞灯光源一般帯一个稳压器,占有相当大体积,而LED光源安全性髙,体积小,可随意搬动,不存在汞泄漏污染和发烫問題。

(5) 汞灯在安装时,需要调节光源中心,换另一汞灯也需要重新校正光路,而用LED不需要光路调节。

(6) 汞灯光源亮度是一定的,要通过减光玻璃来减弱其强度,而LED光源则可通过旋纽来调节亮度。

(7) 汞灯100~200 W,发热量大,需要激发电源,而LED光源可选配、移动,这样突然停电不会影响使用。

由于使用了LED光源,使仪器具有更多优点^[3],因此应该把新型LED光源用到荧光显微镜中来。

国内外LED的主要参数,如表 1所示。

表 1 Tab.1

表 1 LED发光效率对比 Tab.1 Comparison of LED luminous efficiency 国家和地区 发光效率/% 中国 60~68 美国、欧洲 70~80

表 1 LED发光效率对比 Tab.1 Comparison of LED luminous efficiency

从表对比知,显然是欧美的发光效率高些。由于目前国内LED的功率只有5 W,现选用德国LEICA公司的产品,功率为10 W,亮度可调。由于价格比较贵,今后发展的方向还应采用国内的LED,以降低成本。

用于显微镜中的LED外型如图 5所示。

图 5

Fig. 5

图 5 LED外型图 Fig. 5 Outline drawing of LED

原仪器带有2种波长的激发滤光片:1 号激发滤光片波长为510~550 nm;2 号激发滤光片波长为460~490 nm。

为此,配置了 Leica SFL100 型的波长为530 nm和470 nm的2个LED光源^[4],如图 5中1,它有上下2个。分别用2个交换式电源供应器2供电,通过电源插头4插入 LED光源,插到底,并用螺母5拼紧。

这种根据不同的波长,采用磁性定位结构8替代弹性片定位结构的LED切换机构,克服了弹性片容易变形,定位不明显的缺点,目前在国内还没有见到,这也是在技术上的一种创新。

CCD是一种半导体成像器件,具有灵敏度高、抗强光、体积小、畸变小、寿命长、抗震动等优点,所以本文又在原有的仪器上,把数码相机改成CCD摄像装置，如图 6所示。

图 6

Fig. 6

图 6 摄像装置的原理图 Fig. 6 Schematic diagram of photography device

在原有的荧光显微镜1上的数码相机接口2上,安装成像物镜3,通过物镜3成像到CCD 4上,通过图像卡5把CCD接受的信号传到计算机7里,在计算机显示屏上得到要观察的图像。软件6用于图像的归档、保存和对图像的亮度、衬度、颜色等进行调整。这种结构设计时,中继物镜必须要有调焦机构,以保证目镜成像和计算机屏幕同时清晰。

图 7是改制的CCD摄像装置照片,是在原仪器上安装了Leica DFC295摄像装置,代替了原仪器的数码相机,这是本仪器上第2个改制。本摄像装置能通过计算机的软件,把300万像素扩展到700万像素,所以性价比很高。

图 7

Fig. 7

图 7 摄像装置 Fig. 7 Photography device

由于采用了LED新光源,这次改制后视场清晰度达到80%,视场均匀性几乎达到90%,分辨率也有很大提高,并在我院普外、肿瘤等6个学科和17个自然科学基金项目中得到了应用。图 8是仪器改造后所拍摄的荧光试样照片。

图 8

Fig. 8

图 8 荧光试样照片 Fig. 8 Photo of fluorescence specimen

近年来,世界上一些经济发达国家围绕LED的研制展开了技术竞赛,如日本“21世纪光计划”,美国“下一代照明计划”,欧盟“彩虹计划”。我国目前LED产品还属于中、低端的产品,通过本文介绍,如果各大医院能够把现有的荧光显微镜都进行这样的改制,不但能节省大量的外汇,而且也会推动LED工业的发展,为振兴民族工业发挥更大的作用。