激光共聚焦扫描显微镜^[1](laser confocal scanning microscope,LCSM)高度结合光、机、电、计算机和图像处理等技术,使其在光学显微领域具有极其重要的地位。与传统的光学显微镜相比其具有很高的横向和纵向分辨率^[2,3],光学切片式的测量方式可以观测物体的三维结构。其优良的性能在半导体^[4]、材料科学^[5]、生物医学^[6]领域具有广泛的应用。激光共聚焦扫描荧光显微镜是结合激光共聚焦扫描显微镜和激光诱导荧光成像技术^[7]的用于观察细胞内部结构的仪器。

激光共聚焦扫描显微镜以光学共轭焦点(简称共焦)成像技术^[8]为基础,相比传统的荧光显微镜最大的优点在于加上了扫描系统,通过扫描可以对物体进行三维动态检测。扫描系统通常有两种工作方法^[9]:光束扫描和物体扫描。光束扫描就是被扫描物体不动光束运动;物体扫描就是被扫描物体运动光束不动。光束扫描的优点是扫描速度快、精度高;物体扫描的优点是视场大、光学畸变小。

1 激光共聚焦扫描显微镜的原理

激光共聚焦扫描显微镜采用共轭焦点技术,使用激光作为光源,被探测物体和探测器处于彼此对应的共轭焦点位置。如图 1所示,激光器发出的激光光束通过扩束镜扩束形成平行度好、直径合适的平行光束,此光束被二向色镜反射后进入物镜,被物镜聚焦于载物台上的被测物体(以细胞为例)上。被荧光染色的细胞受激光照射后发出另外一种波长的光,反向通过物镜形成和入射光束平行的荧光平行光,荧光可以通过二向色镜而不被反射。通过二向色镜的荧光被透镜聚焦,在焦点处放置有针孔,此处针孔的作用是滤除非焦点处荧光的杂散光,针孔处放置有光电倍增管(PMT)以接收荧光信息。

图 1

Fig. 1

图 1 激光共聚焦扫描显微镜原理图 Fig. 1 Laser confocal scanning microscope principle

PMT前方针孔大小的选择对LCSM成像影响极大,有关针孔大小该如何确定的研究有许多^[10-11],研究表明,当针孔直径恰好等于一个爱里斑直径时,探测器通过针孔接收的光能量最大,成像效果最好。爱里斑通过系统成像的直径为

LCSM成像数据是通过采集卡A/D转换而来,通过采集卡把模拟信号转换为数字信号。由于通过采集卡采集转换的数据没经过任何处理,会带有许多干扰信号,噪声较大。为了得到更好的数据使图像更加清晰,就需要对采集的数据进行处理,以滤除干扰信号。数据处理方法多种多样^[12],最常用的有算术平均值数字滤波、加权平均值数字滤波、滑动平均值滤波、中值滤波等。

由于实验中会有各种随机干扰(随机噪声),实验选用的是算术平均值数字滤波方法,按输入的N个采样数据x_i(i=1,2,3,…,N),寻找y,使y与各采样值间的偏差平方和最小,其公式为

　　GParameters.averages为在每一点采集的数据个数

　　{

　　double[]data=reader.ReadSingleSample();　　读取采集卡采集数据

　　sum=sum+data^[0];　　对某一点所有数据进行累加

　　}

　　sampledata[i,columns -1 -j]= sum/GParameters.averages;　　i、j为行数和列数

}

3 位移平台控制设计

为了达到更好的实验效果,使用PI公司生产的压电陶瓷驱动的六轴纳米位移平台,型号是P-562.6CD,x、y、z轴移动范围均为200 μm,位移精确度为1 nm,完全可以满足高分辨率的需求。采用单点扫描方法控制平台移动,单点扫描就是把单一方向上的量程按要求分成等分点,位移平台移动时在每一个点上停一下,同时采集卡在此采集数据,实验采用每点采集1 000个数据,然后取平均值。

3.1 扫描方式的选择

单点扫描可分为两种扫描方式:梳状波扫描和矩形波扫描。梳状波扫描就是扫描沿着同一个方向进行,也就是说沿x轴的方向不变,x的起始点是一定的;矩形波扫描就是双向来回扫描,也就是说沿着x轴方向在起点和终点来回交替变化。图 2、图 3分别是梳妆波、矩形波扫描的局部路径图。

图 2

Fig. 2

图 2 梳状波扫描局部路径 Fig. 2 Comb wave scanning path

图 3

Fig. 3

图 3 矩形波扫描局部路径 Fig. 3 Rectangular wave scanning path

梳状波扫描程序为:

for(int i=0;i

//PI的y轴对应图像的y(行数)

　　{

　　for(int j=0;j

　　//PI的x轴对应图像的x(列数)

　　{

　　goalPos^[0]= goalPos^[0]+x_grid;

　　}

//移动PI台到新的一行

goalPos^[0]= GParameters.nowPos^[0];

//x轴返回起始位置

goalPos^[1]=goalPos^[1]+y_grid;

//y轴移动一个采集距离

　　}

矩形波扫描程序如下:

for(inti=0;i

　　{

　　　if((i+1)% 2 == 0)//判断奇偶行

　　　{

　　　for(int j=0;j

　　　　　　{

　　　goalPos^[0]=x_Initial+GParameters.xRange

　　　　　　　　　　　　　　　　　　-j*x_grid;

　　　　}

　　　}

　　else

{

　　for(int j=0;j

　　　　{

　　　　　

GoalPos^[0]=x_Initial+j*x_grid;

　　　　}

　　}

goalPos^[1]=y_Initial+(i+1)*y_grid; //y跳到新一行

3.2 位置偏差的补偿

由图 2、图 3可以看出,扫描时位移台移动和设计会有偏差,这是由于位移台移动有加速和减速过程,所以采集卡在采集数据时就会有偏差,也就是说对于细胞上某一点(i,j)预期对应的下一点(i,j+1)可能由于位移台移动时机械误差的原因变成点(i,j+2),如图 4所示。这时可以在程序中弥补机械运动产生的位移偏差,增加代码为:goalPos^[0]=x_Initial+j*x_grid±n;其中n值随实际情况选取,所得效果如图 5所示。

图 4

Fig. 4

图 4 实际带有位置偏差的效果图 Fig. 4 Position deviation

图 5

Fig. 5

图 5 程序纠正的效果图 Fig. 5 Correction by using program

4 实验结果

图 6为所设计的实验装置图。考虑荧光效率,激光器使用的是波长为405 nm的半导体激光器,为了得到大视场范围我们使用了数值孔径为0.95的物镜,本实验所采用的样品是老鼠的神经细胞,其平均尺寸约为10 μm。图 7为本实验的扫描细胞效果图,由图像可以看出,用Visual Studio C#程序控制的扫描对于细胞的扫描成像具有很好的效果。

图 6

Fig. 6

图 6 实验装置图 Fig. 6 Experimental setup

图 7

Fig. 7

图 7 扫描细胞成像图 Fig. 7 Cell image

5 结 论

影响激光共聚焦扫描荧光显微镜系统图像质量的因素有很多,比如光路搭建是不是共轴,数据采集卡的增益系数稳定性,光电倍增管(PMT)的驱动电源的电流电压值是否稳定等等,若要得到好的实验效果需要综合考虑这些因素。